NO抵制并瘧原蟲裂殖子侵入紅細胞相關分子機制的實驗研究.pdf

1、實驗目的：
　　 瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最為嚴重的寄生原蟲感染性疾病?！禢ature》公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，世界上100多個國家為瘧疾流行區(qū)，約22億人口受到瘧疾威脅，每年有300～500萬瘧疾臨床病例，病死人數(shù)高達110～270萬。為此，瘧疾的廣泛流行給全球尤其是發(fā)展中國家?guī)砹顺镣吹慕】滴：蛧乐氐慕?jīng)濟負擔。瘧疾發(fā)病主要源于瘧原蟲在宿主紅細胞內的裂體增殖，而阻斷瘧原蟲對紅細胞的侵入是控制瘧疾發(fā)病的關鍵因素。

2、>　　 瘧原蟲要完成在宿主體內紅內期的發(fā)育，必須通過自身的配體識別宿主紅細胞上的相應受體，從而完成侵入的過程。因此，瘧原蟲表達的配體分子和相應紅細胞的受體之間的相互作用是瘧原蟲侵入過程中的關鍵環(huán)節(jié)。雖然不同種屬的瘧原蟲入侵不同發(fā)育階段的宿主紅細胞(如:間日瘧原蟲(Plasmodium vivax，Pv)入侵網(wǎng)織紅細胞，卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale，Po)入侵成熟的紅細胞，而惡性瘧原蟲（Plasmodium falcip

3、arum，Pf）可入侵所有發(fā)育階段的紅細胞），但是各種屬瘧原蟲均具有相同的形態(tài)學特征和胞漿內器官。這一相似的結構學特征提示，入侵過程中所需的分子機制可能相同。
　　 近年來，隨著瘧原蟲-紅細胞相互作用分子機制研究的深入進行，如裂殖子表面蛋白1(Merozoite surface protein-1，MSP-1)、頂端膜抗原1(Apical MembraneAntigen-1，AMA-1)等在侵入過程中發(fā)揮重要作用的分子，其結構和

4、功能已逐漸明確，相應的瘧疾疫苗也已進入Ⅰ期臨床試驗階段。此外，對裂殖子頂端復合體（一種在原蟲入侵過程中發(fā)揮重要作用的頂端結構）的研究進一步發(fā)現(xiàn)，其組成成分之一的棒狀體(Rhoptry)在入侵過程中也發(fā)揮重要作用。棒狀體由多種蛋白分子組成，是介導瘧原蟲納蟲空泡(Parasitophorous vacuole，PV)形成的重要結構。惡性瘧原蟲棒狀體中大分子蛋白RhopH復合體組成分子分別為RhopH1(155kDa)、RhopH2(140k

5、Da)和RhopH3(110kDa)。約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii，Py) RhopH復合體依照其惡性瘧原蟲同系物分別被命名為PyRhopH1A(135kDa)、PyRhopH2(140kDa)和PyRhopH3(100kDa)。眾所周知，體現(xiàn)瘧原蟲毒力不同的一個鮮明特點是其裂殖子識別和入侵宿主紅細胞的發(fā)育階段不同，近年研究發(fā)現(xiàn)此種選擇性識別入侵機制與棒狀體各組成蛋白間關系密切。體內外實驗觀察均發(fā)現(xiàn)，抗RhopH復合體的

6、特異性抗體可抑制瘧原蟲的生長發(fā)育。利用基因敲除技術對瘧原蟲的研究過程中發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲PfRhoph3基因敲除的瘧原蟲無法存活，提示RhopH complex賦予了瘧原蟲重要的生物學作用。Preiser等人也報道約氏瘧原蟲棒狀體內另一種分子量為235kDa(Py235)的蛋白與裂殖子對紅細胞的粘附及致病力顯著相關，基因組分別定位于約氏瘧原蟲第1、5、6和10號染色體的亞端粒區(qū)。Py235與間日瘧原蟲網(wǎng)織紅細胞粘連蛋白2(RBP-2)、惡性

7、瘧原蟲紅細胞粘連蛋白PfRBP2-Ha和PfRBP2-Hb的基因結構高度近似。蛋白功能分析顯示，抗Py235蛋白的單克隆抗體可改變致死性YM株（可感染所有發(fā)育階段的瘧原蟲）的感染模式，使其與自限性17X株（只感染網(wǎng)織紅細胞）的感染模式相同。這些結果進一步提示RhopH復合體和Py235各家族成員與裂殖子表面分子MSP-1和AMA-1共同參與瘧原蟲-紅細胞粘附機制，并在瘧原蟲入侵宿主紅細胞中發(fā)揮重要的選擇性作用。
　　 不斷積累的

8、研究數(shù)據(jù)表明:瘧原蟲感染早期有效的Th1型免疫應答的建立，在遏制瘧原蟲的裂體增殖和介導瘧疾感染結局方面發(fā)揮著關鍵的作用。一氧化氮(NO)作為Th1型免疫應答的效應分子，在免疫防御中具有不可忽視的作用地位。NO由L-精氨酸在轉變成胍氨酸過程中經(jīng)一氧化氮合酶(NOS)催化形成，可由機體的多種組織細胞產(chǎn)生。其中，誘導型一氧化氮合酶（iNOS或NOS2）誘導產(chǎn)生的NO在抗腫瘤發(fā)生、誘導腫瘤細胞凋亡和抗菌、抗病毒及胞內寄生性原蟲等多種病原生物感染

9、過程中，發(fā)揮著重要的免疫防御作用。瘧原蟲紅外期研究結果顯示，NO可明顯消除瘧原蟲子孢子對肝細胞的感染。我們前期的蚊階段研究觀察發(fā)現(xiàn)，約氏瘧原蟲感染早期自然傳播阻斷現(xiàn)象的出現(xiàn)不是發(fā)生在蚊體內，而是發(fā)生于感染宿主體內，并且與宿主NO產(chǎn)生密切相關。NO可直接抑制配子體向配子的進一步發(fā)育。然而，與肝內期和蚊階段相比，NO在抗紅內期瘧原蟲免疫機制中的作用尚未清楚。一些學者認為NO是控制和消除紅內期蟲體血癥的重要免疫效應分子。iNOS產(chǎn)生增加與感染

10、小鼠存活時間延長密切相關，惡性瘧原蟲感染過程中，無并發(fā)癥瘧疾患者外周血iNOS mRNA水平顯著升高且單核細胞數(shù)量增加;同時，NO還可通過抑制感染惡性瘧原蟲的紅細胞對微血管內皮細胞的粘附保護易感宿主;應用NO發(fā)生劑進行的體外實驗也顯示，NO通過細胞毒效應可明顯抑制夏氏瘧原蟲、柏氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲紅內期原蟲的生長及發(fā)育。然而，也有結果顯示:應用iNOS抑制劑氨基胍(AG)治療后，夏氏瘧原蟲感染小鼠的蟲體血癥水平和存活時間并未出現(xiàn)明顯的變

11、化;用痤瘡丙酸桿菌誘導巨噬細胞產(chǎn)生高水平的NO或注射NOS抑制劑，小鼠的蟲體血癥水平也未見有意義的改變。提示NO水平的升高并不足以清除紅內期感染。然而，某些學者認為NO之所以不能有效殺傷紅內期瘧原蟲（環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體），可能是NO在紅細胞內彌散過程中被血紅蛋白耗竭，因而到達瘧原蟲體的有效NO濃度降低，不能發(fā)揮其非特異性殺傷效應。而裂殖子是瘧原蟲唯一不被宿主紅細胞保護、完全裸露于宿主免疫系統(tǒng)之下，易受效應分子攻擊的發(fā)育階段。因此，深

12、入探討NO在紅內期保護性免疫應答中的作用地位，特別是闡明NO介導裂殖子與紅細胞相互作用的分子機制具有重要的科學意義。
　　 關于NO介導瘧原蟲侵入宿主紅細胞的分子機制至今尚無報道。為此，本研究是在上述系統(tǒng)研究的基礎上，擬利用我們成功建立的Py17XL易感和抵抗鼠瘧模型，通過動態(tài)監(jiān)測紅細胞感染率、利用NO合成前體物質L-精氨酸干預兩種鼠瘧模型免疫應答特點及效應;體內、外監(jiān)測NO產(chǎn)生水平變化對PyMSP1-19、PyAMA-1、Py

13、RhopH復合體和Py235轉錄和表達模式及其介導瘧原蟲粘附機制的影響，以及在瘧原蟲感染周期中Py235表達變異體的種類和其表達模式。進一步確定裂殖子侵入紅細胞的分子機制，以期為探討控制瘧疾發(fā)病的免疫治療提供新的作用靶位，同時為開發(fā)高效的瘧疾發(fā)病阻斷疫苗提供新的理論和實驗依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 1、實驗動物感染及其模型建立
　　 6-8周齡、雌性DBA/2和BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔分別感染1×106 P.

14、y17XL寄生的紅細胞(pRBC)，構建不同的實驗動物模型。感染不同時間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數(shù)紅細胞感染率。L-精氨酸體內處理組小鼠實驗組于瘧原蟲感染前連續(xù)口服給予L-Arg(1.5g/kg BW)7d，對照組在感染前同樣時間點給予同體積生理鹽水。一氧化氮發(fā)生劑配置，用無菌1×PBS配制25mmol/LNOC18，2.5 mmol/LNOC18，100 mmol/LNOC5和25 mmol/LNOC5

15、，長效發(fā)生劑NOC18于小鼠感染后第2天尾靜脈注射，100ul/次/日，短效發(fā)生劑NOC5于感染后6d腹腔注射100ul/只，孵育30min;用RPMI-1640含小牛血清培養(yǎng)液配制1.25mmol/L,2.5 mmol/L，5mmol/L和10 mmol/LNOC5短效一氧化氮發(fā)生劑用于體外實驗，37℃，5％CO2，孵育30min。
　　 2、瘧原蟲成熟裂殖體純化
　　 肝素抗凝，心臟采集感染后第6d小鼠血液(紅細胞感

16、染率達60％～80％)，經(jīng)滅菌纖維素(CF)11過柱，去除白細胞，50％ Percoll密度離心法進一步分離、收集瘧原蟲裂殖體。
　　 3、脾細胞培養(yǎng)及樹突細胞(DCs)的純化
　　 無菌取出感染小鼠脾臟，制成細胞懸液并調整脾細胞終濃度為1×107/ml，24孔培養(yǎng)板上加入細胞懸液，500ul/孔，于37℃培養(yǎng)48h。350g室溫離心10min，收集上清，-80℃保存，待IFN-γ和NO檢測。按照小鼠DCs純化試劑盒說明

17、書所示，從小鼠脾細胞懸液中陰性選擇純化脾DCs。將脾DCs終濃度調整為1×106/ml，于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500ul，培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)上清，-80℃保存，待IL-12p40檢測。
　　 4、采用雙抗體夾心ELISA法檢測小鼠感染瘧原蟲后脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和樹突細胞培養(yǎng)上清中IL-12p40的含量
　　 用雙抗體夾心ELISA法對IFN-γ和IL-12p40含量進行檢測，酶標儀檢測450nm處OD值，

18、應用SoftMaxPro4.3.1 LS軟件分析，繪制標準品標準曲線，計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　 5、NO2-測定
　　 Griess方法檢測經(jīng)培養(yǎng)48h脾細胞上清中NO2-水平。計算其含量(μM)。
　　 6、流式細胞分析技術檢測L-Arg體內干預小鼠感染瘧原蟲后，脾樹突細胞亞群及巨噬細胞活化情況
　　 (1)每份樣品用抗-CD11 c-FITC單克隆抗體、抗-CD111b-PE單克隆抗體和

19、抗-B220-Percp單克隆抗體進行三色分析，另設陰性對照管。預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，再加入抗-CD11 c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體和抗-B220-PerCP單克隆抗體進行表面染色。離心去上清后，洗滌兩次，靜置15min，流式細胞儀進行檢測。
　　 (2)每份樣品用抗-F4/80-FITC單克隆抗體和抗-CD36-PE單克隆抗體進行雙色分析，另設

20、陰性對照管。預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，再加入抗-F4/80-FITC單克隆抗體和抗-CD36-PE單克隆抗體進行表面染色。離心去上清后，洗滌兩次，靜置15min，流式細胞儀進行檢測。
　　 7、實時定量RT-PCR方法檢測侵襲相關分子的轉錄水平
　　 (1) PCR引物利用引物設計軟件Primer5設計約氏瘧原蟲MSP-1、AMA-1、RhopH復合體、Py235家族以

21、及β-actin的特異性引物。
　　 (2) Real-time RT PCR檢測轉錄水平差異:按照TAKARA熒光法Real-timePCR兩步法試劑盒說明書，合成cDNA并進行實時定量PCR實驗。利用相對定量法檢測PyMSP1-19、PyAMA-1、PyRhopH2復合體和11個py235基因家族成員的轉錄水平，t檢驗比較轉錄水平的差異。
　　 8、Western blotting對比檢測侵襲相關分子的翻譯水平

22、>　　 將裂殖體在100ul含有蛋白酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液中-80℃凍融3次，每次冷凍時間30min，在10％ Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)中分離蛋白。分別應用抗PyAMA-1、PyRhopH復合體作為一抗，二抗用羊抗小鼠或羊抗兔HRP熒光抗體，ECL發(fā)光法檢測相應蛋白表達水平。
　　 實驗結果：
　　 1、P.y17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠后不同時間脾臟DCs亞群的數(shù)量

23、>　　 BALB/c和DBA/2小鼠脾臟髓樣樹突細胞(CD11 c+CD11b+DCs)的數(shù)量于感染后3、5d均明顯升高，并且DBA/2小鼠的髓樣細胞數(shù)量和BALB/c小鼠相比具有增高趨勢。而兩種小鼠脾臟漿樣樹突細胞(CD11c+CD45R/B220+DCs)的數(shù)量在感染后3、5d，也呈逐漸增高趨勢，但BALB/c小鼠漿樣樹突的數(shù)量顯著高于DBA/2小鼠。
　　 2、細胞培養(yǎng)上清中Th1型細胞因子IL-12p40和IFN-γ以

24、及免疫效應分子NO的分泌水平
　　 感染后第3d，DBA/2小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平迅速升高，第5d盡管呈下降趨勢，但仍明顯高于正常水平。相比，BALB/c小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平在感染后第3d和第5d均未見有意義的升高;BALB/c和DBA/2兩種小鼠于感染后第3～5d的IFN-γ水平均出現(xiàn)有意義的升高;但DBA/2小鼠IFN-γ產(chǎn)生水平顯著高于BALB/c小鼠。兩種小鼠NO水平于感染后第3

25、～5d也出現(xiàn)有意義升高，但DBA/2小鼠NO升高的水平明顯高于BALB/c小鼠。
　　 3、L-Arg處理后不同時間P.y17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠脾臟DCs亞群的數(shù)量
　　 L-Arg處理組的BALB/c小鼠髓樣和漿樣DCs于感染后3、5d明顯升高，顯著高于Py17XL正常感染組，從兩種DCs亞群的活化程度來看，BALB/c正常感染組小鼠漿樣DCs略占優(yōu)勢，而L-Arg處理的BALB/c感染組小鼠髓樣DC

26、s活化程度明顯優(yōu)于漿樣DCs; L-Arg處理組的DBA/2小鼠髓樣和漿樣DCs于感染后3、5d明顯升高，并且以髓樣DCs活化為主。
　　 4、兩種小鼠經(jīng)L-Arg處理感染Py17XL后不同時間脾巨噬細胞的數(shù)量
　　 Py17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠正常感染組和經(jīng)L-Arg處理組，巨噬細胞在感染后3、5d數(shù)量均高于未感染小鼠，但兩組小鼠之間無統(tǒng)計學差異，但兩組小鼠活化的巨噬細胞數(shù)量存在明顯不同，在感染后3d，

27、L-Arg處理組小鼠巨噬細胞的活化數(shù)量明顯高于正常感染組。
　　 5、Py17XL感染BALB/c和DBA/2小鼠經(jīng)L-Arg處理后不同時間脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和NO的水平
　　 BALB/c和DBA/2小鼠經(jīng)L-Arg干預后，小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和NO水平明顯高于正常感染組，特別是有利于BALB/c小鼠IFN-γ和NO的產(chǎn)生，小鼠于感染后5d IFN-γ的水平仍高于正常感染組。
　　 6、通過R

28、eal Time RT-PCR檢測NO發(fā)生劑體內處理Py17XL感染BALB/c小鼠，各侵襲相關分子基因的轉錄模式
　　 NO短效發(fā)生劑NOC5對重要的瘧原蟲紅內期侵襲蛋白AMA1，MSP1和RhopHcomplex具有一定的抑制作用，并且這種抑制作用在AMA1和MSP1兩個呈劑量依賴性;NO長效發(fā)生劑NOC18顯示對AMA1，MSP1和RhopH complex這三個基因的轉錄水平不如短效發(fā)生劑明顯，僅在高濃度時對MSP1的轉

29、錄水平起到上調作用而在低濃度時對RhopH complex轉錄起到抑制作用，但不如NOC5有規(guī)律可循。對Py235家族的轉錄水平的影響可見長效NO發(fā)生劑NOC18對＃2104和＃5054具有抑制作用，而對＃3534在濃度高時具有抑制作用而在濃度低時具有上調作用;短效NO發(fā)生劑NOC5對Py235家族的影響顯示對＃2104和＃3534具有上調作用，高濃度時對＃4930具有上調作用，而對其他家族基因具有下調作用。
　　 7、通過Re

30、al Time PCR檢測NO短效發(fā)生劑NOC5不同濃度體外處理Py17XL純化裂殖體，各侵襲相關分子基因的轉錄模式
　　 NO短效發(fā)生劑NOC5體外處理Py17XL純化裂殖體可見對RhopH complex的轉錄水平未見影響，對AMA1和MSP1在濃度5mmol/L時具有一定上調作用，而在濃度10mmol/L時對MSP1水平具有一定下調作用;而對Py235家族基因的轉錄水平表現(xiàn)在濃度1.25mmol/L時對＃2104，＃318

31、4，＃3432和＃4930具有一定下調作用，在濃度2.5mmol/L時對＃2104具有下調作用而對＃3184和＃4930具有一定的上調作用，在濃度5mmol/L時對＃649有上調作用而對＃2104具有下調作用，而在10mmol/L時對＃649，＃1365以及＃2104具有下調作用。
　　 8、通過Western Blot檢測NO發(fā)生劑體外處理致死型約氏瘧原蟲裂殖體AMA1和RhopH complex蛋白的表達模式
　　

32、體外不同濃度短效NO發(fā)生劑NO5(1.25mmol/L，2.5mmol/L，5mmol/L和10mmol/L)處理純化的Py17XL裂殖體，利用Western Blot檢測AMA1和RhopHcomplex蛋白的表達顯示，NOC5對AMA1表達具有抑制作用，并且這種抑制作用具有劑量依賴性，而NOC510mmol/L時對RhopH complex蛋白具有抑制作用。
　　 結論：
　　 1、P.yoelii17XL感染早期，

33、易感小鼠BALB/c和抵抗小鼠DBA/2在Th1型細胞免疫應答存在明顯差異，這種Th1型免疫應答可能是通過DCs分泌IL-12介導的。
　　 2、P.yoelii17XL感染早期，易感小鼠BALB/c和抵抗小鼠DBA/2在巨噬細胞產(chǎn)生數(shù)量和NO產(chǎn)生水平存在明顯差異。
　　 3、L-Arg能顯著降低感染BALB/c和DBA/2小鼠的原蟲血癥水平并延長易感小鼠的生存率。
　　 4、L-Arg通過DCs活化來強化Th1

34、型應答進而遏制P.y17XL感染早期紅內期瘧原蟲的感染進程。
　　 5、100ul，25mmol/L和100mmol/L NO5體內注射Py17XL感染BALB/c小鼠30min可下調決定瘧原蟲侵入的關鍵蛋白MSP1和AMA1的轉錄水平，并呈劑量依賴性。
　　 6、NO發(fā)生劑（長期或短期）體內干預P.y17XL感染BALB/c小鼠，瘧原蟲在NO壓力下由弱毒力株向強毒力株轉變。
　　 7、體外不同濃度NOC5干預P