MAGE-A3基因在肝癌組織中的表達(dá)及對肝癌的免疫保護(hù)研究.pdf

1、目的：
　　檢測黑色素瘤抗原A3（Melanoma antigen A3, MAGE-A3）在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表達(dá)情況，為MAGE-A3抗原對HCC患者進(jìn)行特異性免疫治療及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。構(gòu)建小鼠pcDNA3.1-MAGE-A3真核表達(dá)載體，提取質(zhì)粒DNA免疫小鼠，觀察接種小鼠肝癌細(xì)胞株H22的成瘤情況，探討MAGE-A3基因疫苗對HCC的免疫保護(hù)作用。
　　方

2、法：
　　1.收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院HCC新鮮標(biāo)本56例，提取HCC及相應(yīng)癌旁肝組織mRNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄―聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測MAGE-A3基因的表達(dá)；應(yīng)用組織芯片和免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察HCC組織及相應(yīng)癌旁組織中MAGE-A3蛋白的表達(dá)，分析MAGE-A3陽性表達(dá)與HCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　2.化學(xué)合成小鼠MAGE-A3全長基因，限制性內(nèi)切酶EcoRI/XhoI酶切小鼠MAGE-A3基因和真核

3、表達(dá)載體pcDNA3.1（+）質(zhì)粒，T4DNAligase連接酶切片段，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行酶切和測序鑒定。
　　3.培養(yǎng)人腎上皮細(xì)胞株293T，重組pcDNA3.1(+)-MAGE-A3載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，western-blot檢測MAGE-A3蛋白的表達(dá)。
　　4.培養(yǎng)小鼠肝癌細(xì)胞H22，5-Aza-Cdr誘導(dǎo)H22細(xì)胞表達(dá)MAGE-A3基因；抽提質(zhì)粒DNA，大腿肌肉注射法免疫小鼠，每間隔7d免疫一次，

4、第三次免疫后第七天，小鼠腋窩皮下注射MAGE-A3陽性的H22細(xì)胞，每日觀察小鼠成瘤情況，ELISA法檢測小鼠血清MAGE-A3抗體。
　　結(jié)果：
　　1. RT-PCR檢測 HCC組織中MAGE-A3 mRNA的陽性表達(dá)率為64.29％（36/56），癌旁肝組織和遠(yuǎn)癌肝組織均不表達(dá)MAGE-A3基因(0/58)，二者間差異具有顯著性(P<0.01)；免疫組化技術(shù)檢測 HCC組織中 MAGE-A3蛋白陽性表達(dá)率為53.9%（

5、76/141），染色位于胞質(zhì)，多為彌漫陽性，而相應(yīng)癌旁組織均不表達(dá) MAGE-A3蛋白，二者間差異具有顯著性(P<0.01)。
　　2.成功構(gòu)建 pcDNA3.1(+)-MAGE-A3真核表達(dá)載體。雙酶切鑒定獲得大小約為1kb的片段，與MAGE-A3大小相符；經(jīng)測序鑒定顯示，測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致（Gene Bank ID:17139）。
　　3.將 pcDNA3.1(+)-MAGE-A3真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，

6、western blot檢測見陽性蛋白條帶，蛋白大小為40KD，證明 pcDNA3.1(+)-MAGE-A3載體能有效表達(dá)目的蛋白。
　　4.含5-Aza-Cdr的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)小鼠HCCH22細(xì)胞6天后，RT-PC R檢測證實(shí)H22細(xì)胞表達(dá)MAGE-A3基因。
　　5.真核表達(dá)載體免疫3次后，小鼠接種MAGE-A3基因陽性表達(dá)的H22細(xì)胞?？蛰d體組和生理鹽水組小鼠第9天可觸及腫瘤結(jié)節(jié)，重組載體組第11天觸及腫瘤結(jié)節(jié)；第15

7、天處死小鼠，重組載體組腫塊的體積和重量明顯高于空載體組和生理鹽水組（P<0.05）；ELISA檢測小鼠血清中出現(xiàn)MAGE-A3抗體。
　　結(jié)論：
　　1. MAGE-A3基因在HCC組織中有較高表達(dá)，MAGE-A3抗原表達(dá)與腫瘤大小、AFP、HBsAg、復(fù)發(fā)、肝硬化背景、包膜和腫瘤分化程度均無關(guān)，與鏡下脈管癌栓呈正相關(guān)。
　　2.成功構(gòu)建 pcDNA3.1(+)-MAGE-A3真核表達(dá)載體，能在體外能有效表達(dá)目的蛋白。