約氏瘧原蟲紅外期相關基因及宿主抗瘧原蟲子孢子感染免疫分子研究.pdf

1、蚊媒傳播的瘧疾是一種嚴重危害人類健康的熱帶傳染病，在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率，影響流行地區(qū)經(jīng)濟和社會發(fā)展，威脅著100多個國家近40％的世界人口，在熱帶和亞熱帶地區(qū)尤為嚴重。雖然經(jīng)過瘧疾工作者長期不懈的努力探索，但是目前全世界每年大約有3～5億人感染，約1～3百萬患者因瘧疾感染而死亡，其中絕大多數(shù)是五歲以下的兒童。在我國南方地區(qū)，尤其是山區(qū)，在特定的環(huán)境下仍有大規(guī)模流行的可能。近年來，隨著瘧原蟲多藥抗性株的出現(xiàn)與迅速擴散以及

2、蚊媒對殺蟲劑耐受性的增加，而目前又無有效的抗瘧疫苗，這給瘧疾防治工作帶來很大的困難。瘧疾控制工作正面臨巨大的挑戰(zhàn)，尋求新型、高效、安全的瘧疾控制策略已迫在眉睫。 瘧疾由感染性蚊媒叮咬傳播，瘧原蟲子孢子進入血循環(huán)后可迅速粘附并侵入肝細胞，完成紅外期增殖之后才侵入紅細胞導致瘧疾發(fā)作。所以干擾裂殖子在肝細胞內的發(fā)育是防止瘧疾傳播與臨床癥狀出現(xiàn)的關鍵。因此研制靶向紅外期瘧原蟲的疫苗不僅可防止紅內期瘧原蟲導致的病理損傷，還可阻斷配子體傳播

3、。然而宿主肝細胞、肝組織所產(chǎn)生的高背景干擾，以及難以獲得足量高純度肝期瘧原蟲的技術障礙嚴重阻礙了瘧原蟲紅外期的研究。但隨著分子生物學和生物化學技術的發(fā)展，瘧原蟲紅外期方面的研究已經(jīng)越來越受到人們關注。 瘧原蟲抗原差異與變異十分普遍，并具有非常復雜的抗原結構和眾多不同的抗原表位，多數(shù)抗原表位在生活史不同時期具有階段特異性，此外瘧原蟲還存在種、株特異性及抗原性弱等特點，侵入宿主體后可引起復雜的免疫反應。T細胞免疫在瘧原蟲引起的免疫應

4、答中具有至關重要的地位，因此，研究誘導T細胞活化的共刺激分子在紅外期免疫中的作用是瘧疾治療及疫苗研制的基礎。 因此本課題以分離獲得的約氏瘧原蟲子孢子經(jīng)尾靜脈注射感染大鼠，建立約氏瘧原蟲-斯氏按蚊-哺乳動物宿主模型，對紅外期瘧原蟲在宿主體內發(fā)育變化以及宿主免疫系統(tǒng)接受瘧原蟲刺激后所產(chǎn)生免疫應答的兩個方面進行研究：一方面應用差異顯示PCR(differentialdisplayPCR，DD-PCR)技術篩選約氏瘧原蟲紅外期cDNA，

5、經(jīng)比較分析獲得的差異序列，克隆至TA載體，根據(jù)序列同源分析和功能預測結果，推測可能與瘧原蟲紅外期發(fā)育相關的基因；另一方面采用RT-PCR與直接免疫熒光反應、激光共聚焦技術相結合的方法，從基因和共刺激分子表達情況對宿主針對瘧原蟲抗原刺激產(chǎn)生的免疫反應進行研究。實驗內容和結果主要包括以下幾個方面： 1.針對瘧原蟲基因A+T含量高(＞70％)的特點，本實驗通過改變常規(guī)DD-PCR引物的A+T含量，設計能從肝組織和瘧原蟲混存樣本中特異擴

6、增瘧原蟲基因的A+T含量60％的引物，與DD-PCR技術相結合，繞過了純化裂殖子的技術屏障，特異擴增瘧原蟲基因。將得到的核酸序列登陸GenBank數(shù)據(jù)庫，通過Blast查詢，并進行序列同源性比對、分析，結果顯示在21個待測克隆中：有8個與約氏瘧原蟲紅外期相關基因(PyHs4、PyHs5、PyHs6、Pyrts7、PyHs8、PyHs9、PyHslO、PyHs11)；其中PyHs4與約氏瘧原蟲乙酰葡萄糖胺磷酸變位酶(Phosphoacet

7、ylglucosaminemutase，AGM)具有相似性，PyHs5與約氏瘧原蟲紅細胞膜蛋白3(Erythrocytemembranceprontein，EMP3)具有同源性，PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9、PyHs10、PyHs11為功能未知基因。發(fā)現(xiàn)、鑒定的瘧原蟲差異基因，為進一步研究瘧原蟲紅外期生長發(fā)育的分子機制提供了理論基礎。 2.采用RT-PCR方法對不同時相點宿主免疫相關基因B7.1、B7.2、TG

8、F-β、IFN-γ進行定性、定量分析，探討感染瘧原蟲后哺乳動物宿主體內免疫相關基因變化情況：在宿主體感染約氏瘧原蟲后2～72h，B7.1表達幾乎沒有變化；B7.2、TGF-β、IFN-.γ轉錄水平顯著上調(P＜0.05)。該結果顯示瘧原蟲侵入可能引發(fā)哺乳動物機體免疫防御、免疫調控等一系列相關反應。將直接免疫熒光反應和激光共聚焦技術相結合，觀察瘧原蟲感染后共刺激分子B7.1、B7.2的表達定位情況，實驗發(fā)現(xiàn)：在所選擇的時相區(qū)間內，B7.1

9、、B7.2分子表達有升高趨勢，其中B7.1分子上升速度較緩慢在72h后開始下降，而B7.2分子上調迅速在48h達到峰值后于72h出現(xiàn)回落；在瘧原蟲感染后的2～72h，B7.2的表達水平始終高于B7.1(P＜0.05)。此外，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示：瘧原蟲感染后，B7.1、B7.2分子在巨噬細胞的表達隨著時間點推延從細胞漿、細胞核逐漸轉移到細胞膜。根據(jù)該現(xiàn)象我們可以推測：接受瘧原蟲刺激后，共刺激分子開始活化，其合成、表達增加并可能與