DNase B基因的克隆及在大腸桿菌中的表達.pdf

1、內(nèi)容提要　　DNaseB是A族溶血性鏈球菌的一種分泌蛋白，序列高度保守，幾乎存在于所有A族β-溶血性鏈球菌中，可用于抗DNA酶B的檢測。抗DNA酶B檢測是Jones標準所推薦的鏈球菌感染及其并發(fā)癥的兩種實驗診斷方法之一。然而，A族β-溶血性鏈球菌的液體培養(yǎng)需要微需氧條件，而且存在高致病性，純化天然DNaseB危險大，工藝復雜，成本高，不利于大量臨床檢測的開展。為此，本實驗克隆了DNaseB基因，構(gòu)建了一個原核表達載體，并且成功的在大腸

2、桿菌中表達了這個蛋白?！　”緦嶒炌ㄟ^PCR方法擴增出DNaseB基因，連接入T載體，測序結(jié)果證實序列正確。再次PCR，用KpnⅠ、HindⅢ雙酶切PCR產(chǎn)物，后與同樣酶切的pET-41a(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，菌落PCR及酶切鑒定證實DNaseB基因片段插入表達，測序結(jié)果表明本實驗所克隆的DNaseB基因與GenBank中登錄的基因序列同源性在98％以上。表達菌用1mmol/L的IPTG誘導4小時，

3、收集菌體，破菌，離心，分離上清液和包涵體。SDS-PAGE顯示，目的蛋白主要以可溶蛋白的形式存在，部分以包涵體形式存在。上清液經(jīng)Ni-NTA凝膠親和層析，純度達到91.5％以上。Western-blotting結(jié)果顯示，重組的GST-DNaseB融合蛋白能夠特異的與GAS感染患者的陽性血清反應(yīng)，在55KD處有一條明顯的條帶。ELISA實驗顯示重組蛋白的抗原特異性良好。說明本實驗表達的融合蛋白的具有良好的免疫反應(yīng)性。為抗DNaseB抗體的