乳香主要活性成分AKBA和KBA的體外代謝穩(wěn)定性研究.pdf

1、目的：本論文選用乳香中的主要活性成分乙酰-11-羰基-β-乳香酸(AKBA)和11-羰基-β-乳香酸（KBA）進行體外代謝穩(wěn)定性研究，主要目的是研究其代謝特點，鑒定代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，明確其主要代謝途徑，揭示參與代謝的單酶亞型，闡明動力學(xué)特點和相關(guān)參數(shù)（Vm，Km，CLint），并進一步考察主要代謝通路的種屬間差異，并評價AKBA和KBA主要代謝產(chǎn)物的生物活性并明確其作用機制，揭示主要代謝通路對其生物活性的影響。
　　方法：(1)

2、利用生物合成法制備代謝產(chǎn)物，并結(jié)合天然藥物化學(xué)的分離、純化方法和波譜學(xué)手段（LC-MS、NMR）鑒定代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，確定其主要代謝位點；(2)運用體外代謝顯型技術(shù)，使用人原代肝細(xì)胞、人肝微粒體、人腸微粒體、各類型酯酶、重組單酶及常用實驗動物肝微粒體對AKBA和KBA的代謝通路和種屬間差異進行系統(tǒng)篩選、對代謝酶歸屬、動力學(xué)模型、表觀動力學(xué)參數(shù)和單酶貢獻率進行確定；(3)選用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型，利用Griess法

3、，MTT法，western blotting以及激光共聚焦免疫法來考察AKBA和KBA及其主要代謝產(chǎn)物的抗炎活性和細(xì)胞毒性并研究其抗炎機制。
　　結(jié)果：本課題通過系統(tǒng)地研究AKBA和KBA的代謝穩(wěn)定性，確定了AKBA的主要代謝通路為酯酶水解為KBA，KBA的主要代謝通路為I相CYP代謝；首先生物合成了KBA的四個主要代謝產(chǎn)物，并通過NMR鑒定了其結(jié)構(gòu)，確定四種代謝產(chǎn)物分別為KBA的21位，16位，30位，20位單羥基化產(chǎn)物，其中有

4、三個化合物為首次報道的新化合物；其次由動力學(xué)實驗得到不同生物樣本中AKBA和KBA代謝的動力學(xué)參數(shù)（Km，Vmax、CLint、Ki）；接著AKBA在人原代肝細(xì)胞的代謝實驗中發(fā)現(xiàn)有大量KBA（46.7%）和KBA單羥基化產(chǎn)物（50.8%）生成，而僅殘余極少量AKBA（2.5%），這與其代謝穩(wěn)定性和動力學(xué)實驗中AKBA的快速水解和KBA單羥基化反應(yīng)結(jié)果一致，最后確定了羧酸酯酶介導(dǎo)的AKBA水解反應(yīng)和CYP450介導(dǎo)的KBA單羥基化反應(yīng)是A

5、KBA和KBA主要的代謝通路；通過單酶歸屬、化學(xué)抑制實驗、單酶貢獻率研究結(jié)果可知，羧酸酯酶2（CE2）選擇性催化AKBA脫乙?；蒏BA；單酶CYP3A4、CYP3A5及CYP3A7均能催化KBA氧化反應(yīng)，其中CYP3A4起主要的催化作用。值得注意的是，AKBA的脫乙酰反應(yīng)和KBA的羥基化反應(yīng)均表現(xiàn)出很大的種屬差異性，AKBA的水解反應(yīng)只在人肝微粒體和人原代肝細(xì)胞中發(fā)生，在多種種屬肝微粒體中未檢測到水解產(chǎn)物；而KBA的21位和20位單

6、羥基化產(chǎn)物主要在人肝微粒體、猴肝微粒體中檢測到，16位和30位單羥基化產(chǎn)物主要在其他種屬中檢測到。另外，四個KBA的單羥基化產(chǎn)物均有一定的抗炎活性，且與原型藥物相比細(xì)胞毒性有所降低，通過深入研究抗炎機制，發(fā)現(xiàn)KBA在人中的主要代謝產(chǎn)物21位和20位單羥基化產(chǎn)物是通過下調(diào) LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中 iNOS以及 phospho-IkBα和phospho-p65的蛋白水平，并顯著抑制NF-κB p65由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，從而發(fā)

7、揮其抗炎作用的。
　　結(jié)論：本論文首次對AKBA和KBA在不同生物樣本中的代謝穩(wěn)定性進行了系統(tǒng)地研究，闡明了其主要代謝通路、相關(guān)的動力學(xué)模型和表觀動力學(xué)參數(shù)等，為中藥乳香及其主要活性成分AKBA和KBA的臨床用藥提供參考；首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)CYP450代謝后的KBA主要代謝產(chǎn)物具有相對母體化合物較低的細(xì)胞毒性和較好的抗炎活性，這為乳香中主要活性成分AKBA和KBA開發(fā)低毒的小分子非甾體抗炎藥，提供一定的參考；此外，AKBA和KBA的代謝存