胰島素對擬胚體表達(dá)多能性和分化標(biāo)志基因的影響.pdf

1、目的:
　　 探索不同濃度胰島素對懸浮培養(yǎng)的擬胚體的生長分化的影響。
　　 方法:
　　 本實(shí)驗(yàn)采用懸浮培養(yǎng)法使ES細(xì)胞形成EB,并在體外持續(xù)培養(yǎng)7天,來模擬早期胚胎從ICM向三胚層體系分化的過程。在EB培養(yǎng)基中加入不同濃度的胰島素0pM、6pM、60pM、600pM、6nM作用于EB,分別在EB形成第3天、第5天、第7天提取RNA,通過RT-PCR來檢測Oct4(多能性)、Nanog(多能性)、原始內(nèi)胚層標(biāo)志基

2、因Gata6、中胚層標(biāo)志基因Brachyury、上胚層標(biāo)志基因Fgf5在EB中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、無胰島素組的EB在第7天時(shí)細(xì)胞狀態(tài)不佳,胰島素處理各組的EB在第7天仍能保持良好的生長狀態(tài)。
　　 2、當(dāng)胰島素濃度為0pM、6pM、60pM時(shí),Oct4、Nanog在EB中的表達(dá)隨時(shí)間延長均呈下調(diào)趨勢,無胰島素組的Oct4、Nanog表達(dá)值明顯低于胰島素各組；而在600pM組和6nM組,Oct4、Na

3、nog表達(dá)表現(xiàn)為先升后降,呈現(xiàn)表達(dá)延遲的趨勢。
　　 3、原始內(nèi)胚層標(biāo)志基因Gata6的表達(dá)在胰島素各組隨時(shí)間呈上調(diào)趨勢,其表達(dá)的峰值位于60pM組的EB第7天,在無胰島素組Gata的表達(dá)量較胰島素各組低。
　　 4、中胚層標(biāo)志基因Brachyury在低濃度胰島素組(6pM、60pM)中第3天即開始表達(dá),以60pM組表達(dá)最明顯,隨時(shí)間延長表達(dá)下降；而在高濃度胰島素組,Brachyury的表達(dá)明顯延遲,600pM組在EB第

4、5天開始表達(dá),6nM則在第7天開始表達(dá)。
　　 5、上胚層標(biāo)志基因Fgf5在低濃度胰島素組(6pM、60pM)中第3天開始表達(dá),且呈現(xiàn)先升后降的趨勢；而在600pM組中,Fgf第3天的表達(dá)明顯低于低濃度組,6nM組在第5天才開始表達(dá)Fgf5。
　　 6、ES細(xì)胞表達(dá)Oct4和Nanog強(qiáng)于EB,而ES細(xì)胞幾乎不表達(dá)Gata6、Brachyury、Fgf5。
　　 結(jié)論:
　　 60pM濃度的胰島素能促進(jìn)E