胰島素對擬胚體早期心臟發(fā)育相關(guān)標(biāo)志基因時序性表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　探索不同濃度胰島素對懸浮培養(yǎng)的擬胚體早期分化過程中心臟特異性基因時序性表達(dá)的影響。
　　方法:
　　本實驗采用懸浮培養(yǎng)法使小鼠胚胎干細(xì)胞細(xì)胞(embryonic stemcell，ES cells)形成擬胚體(embryoid body, EB)，并在體外持續(xù)培養(yǎng)11天，來模擬早期胚胎從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner Cell Mass，ICM)向三胚層體系分化的過程。在EB培養(yǎng)基中加入不同濃度的胰島素(60pM、6

2、nM)，分別于EB形成第1、3、5、7、9、11天提取mRNA，通過熒光定量PCR來檢測心臟發(fā)育相關(guān)基因Gata4、Mef2c、Tbx1、Lrrc10在EB中時序性表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.從形態(tài)上，EB在60pM組第5天即出現(xiàn)囊腔化趨勢，第7天囊腔化更明顯;而在6nM組EB第7天才出現(xiàn)囊腔化趨勢，囊腔化趨勢不明顯，滯后于60pM組。
　　2.Gata4是心臟細(xì)胞發(fā)育的早期標(biāo)志基因，在胰島素各組均有表達(dá)，其表達(dá)

3、在60pM組第3天達(dá)到第一峰值，之后隨時間延長而減弱，至EB培養(yǎng)第5天又穩(wěn)步增加，在第7天達(dá)到第二峰值;而在6nM組，Gata4表達(dá)明顯延遲，在EB培養(yǎng)第5天達(dá)到第一個峰值，之后隨時間延長逐漸減弱，至EB培養(yǎng)第7天又增加，在第9天達(dá)到第二峰值。
　　3.Mef2c是心房心室均表達(dá)的心臟特異性基因。Mef2c的表達(dá)量在60pM組和6nM組中均隨時間延長而增加，其表達(dá)峰值均位于EB培養(yǎng)第7天，但6nM組中第3、5、7、9天Mef2c的

4、表達(dá)量較60pM組均低。
　　4.Tbx1是第二生心區(qū)發(fā)育的標(biāo)志性基因。Tbx1在60pM組的表達(dá)隨著時間延長而增加，其表達(dá)峰值位于EB培養(yǎng)第7天，而Tbx1基因在6nM組的表達(dá)無明顯高峰，且第1、3、7、9天Tbx1表達(dá)量均低于60pM組。
　　5.Lrrc10是心臟環(huán)化的特異性基因。Lrrc10的表達(dá)在60pM及6nM組中均隨時間延長而逐漸上調(diào)，至第9天達(dá)到高峰而后下調(diào);但6nM組各階段的表達(dá)量均低于60pM組。

5、　　結(jié)論:
　　1.不同濃度胰島素可影響心臟發(fā)育相關(guān)標(biāo)志基因Gata4、Mef2c、Tbx1、Lrrc10的表達(dá)，與6nM濃度的胰島素組相比，60pM濃度的胰島素有利于擬胚體心臟發(fā)育相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)。
　　2.在相同胰島素濃度下，隨培養(yǎng)時間的不同，Gata4、Mef2c、Tbx1、Lrrc10基因表達(dá)水平不同，其中Gata4于第3天達(dá)首個高峰，第7天達(dá)第二個高峰，Mef2c、Tbx1于第7天達(dá)高峰，Lrrc10于第9天達(dá)高