干擾βTC-3細胞上胰島素受體表達對胰島素一相分泌的影響.pdf

1、研究背景：
　　據(jù)世界衛(wèi)生組織有關資料研究表明，在二十世紀八十年代中期，糖尿病患者總量在3000萬人左右，至九十年代中期十年間，增長4倍，達到1.2億人，預計到2005年全球糖尿病患者總量將再翻一番，達到2.4億人，年平均增長率10％左右。我國糖尿病患病率近10年內增長很快，1980年患病率約為6.09‰，1993年患病率達2.5％，較10年前增長4倍。死亡率已上升至繼腫瘤、心血管疾病之后的第三位。糖尿病帶來的健康和經(jīng)濟問題已成為

2、困擾國民的難題。
　　2型糖尿病的主要發(fā)病機制是胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗。胰島素受體一直被作為研究胰島素抵抗、2型糖尿病的主要候選基因，但胰島素受體在胰島素抵抗中所扮演的角色仍不清楚。胰島素受體編碼基因突變可直接導致胰島素效應的降低；胰島素受體基因及蛋白表達量下調或胰島素受體降解增加可導致胰島素分泌障礙。上世紀80年代證實胰島β細胞上有胰島素受體和四種胰島素受體底物蛋白（insulin receptor substrates,I

3、RS）-1,2,3,4及其下游的轉導蛋白表達，如PI3K,p70s6k等。胰島β細胞中的胰島素信號轉導蛋白可以被葡萄糖或直接被胰島素刺激所活化，提示胰島β細胞也是胰島素作用的靶細胞。因此有學者提出了“β細胞上胰島素抵抗學說”。β細胞上胰島素受體表達異常對葡萄糖刺激下的胰島素的第一時相分泌產(chǎn)生影響的研究很少。故本研究采用RNA干擾（RNA interference,RNAi）技術，使βTC-3細胞上胰島素受體mRNA表達下調，觀察其對葡萄

4、糖刺激下胰島素第一時相分泌量的影響，并分析其量效關系，為2型糖尿病的發(fā)病機制研究提供新的資料。
　　目的：
　　建立小鼠胰島β細胞瘤細胞βTC-3胰島素受體下調模型，用含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液孵育，檢測0、3、5、10分鐘時的胰島素分泌量，探討β細胞上胰島素受體表達對第一時相胰島素分泌的影響及其量效關系。
　　方法：
　　化學合成胰島素受體基因的4對特異siRNAs（實驗組：siRNA-1組，siRNA-2組，s

5、iRNA-3組，siRNA-4組）和1對非特異siRNA（NC組）。通過陽離子脂質體將siRNAs分別轉染βTC-3細胞，24h后熒光顯微鏡下觀察不同濃度siRNA轉染細胞的效率；同時應用逆轉錄PCR檢測胰島素受體mRNA表達；放射免疫法測量細胞在高糖刺激下的胰島素第一時相分泌量。
　　結果：
　?、?0、100、150、200nmol/LsiRNA轉染βTC-3細胞24h后，轉染效率分別為(73.1±4.07)％、(92.

6、9±3.35)％、(90.8±4.02)％、(93.9±2.81)％，故選擇100nmol/L濃度作為siRNA轉染濃度。②轉染100nmol/LsiRNAs24h后，與對照組相比siRNA-1、2、3、4組βTC-3細胞胰島素受體mRNA表達分別下調了62％、78.8％、0％和7.4％。③葡萄糖刺激的胰島素一相分泌在5分鐘峰值時siRNA-1組較對照組下降約27.7％，siRNA-2組較對照組下降約28.6％，siRNA-3組較對照組