植物(煙草)吡哆胺—吡哆醛轉(zhuǎn)換反應(yīng)作用酶的分離純化及表征.pdf

1、維生素B6(VB6)是一種水溶性維生素,游離型為吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)和吡哆醛(Pyridoxal,PL),相應(yīng)磷酸酯形式為磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)。其中PLP是VB6的主要輔酶形式,參加催化涉及氨

2、基酸的各種代謝反應(yīng),在其他多種物質(zhì)的合成和代謝過程中也發(fā)揮著重要作用。
　　PM-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(PPAT)和PM-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶可以催化PM與PL之間的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng),同時(shí),谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)在脫去輔酶PLP后,可以催化PM與PL之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng),但是這些都只是在微生物和動(dòng)物中被證實(shí),植物中同樣存在PM與PL之間的相互轉(zhuǎn)換,但是作用酶尚不明確。
　　煙草作為一種模式植物,廣泛用于植物生理生化的研究。本文以煙草為材料,對(duì)煙草體內(nèi)

3、的GOT和PPAT進(jìn)行分離純化,為植物體內(nèi)VB6的代謝途徑的研究奠定基礎(chǔ)。
　　本文采用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換、Sephadex G-100凝膠過濾等步驟,對(duì)煙草GOT進(jìn)行純化,結(jié)果顯示:GOT被純化了102.66倍。GOT為PLP依賴型酶,本文研究表明PLP存在時(shí)GOT并不催化以吡哆胺為底物的轉(zhuǎn)氨反應(yīng),但去除PLP后,GOT可以催化以吡哆胺和草酰乙酸為底物的轉(zhuǎn)氨反應(yīng);而以L-天冬氨

4、酸和a-酮戊二酸為底物時(shí),GOT活性隨PLP釋放量增大而減小,這與動(dòng)物中GOT的性質(zhì)相同。
　　因此本文采用同樣的純化方法對(duì)煙草PPAT進(jìn)行純化,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示:PPAT被純化了82.79倍。以PM和丙酮酸為底物,純化最后一步的PPAT酶液仍表現(xiàn)出較大活性,可初步認(rèn)定植物體內(nèi),催化PM與PL之間的相互轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)氨酶為PPAT。對(duì)PPAT的部分酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)β-巰基乙醇和EDTA會(huì)抑制酶活力,其中β-巰基乙醇幾乎