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文檔簡介
1、人體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性過高是引起高血壓的關(guān)鍵因素。ACE抑制肽能競爭性地與ACE活性中心結(jié)合,而抑制ACE的活性,起到降血壓的作用?,F(xiàn)有研究表明,這些多肽分子量大都在200-2000之間,且以2-10個氨基酸殘基組成的肽較為多見。近年來,國內(nèi)外利用食物蛋白獲取ACE抑制肽的研究廣泛開展,日本已有產(chǎn)品上市。目前,我國在這方面的研究逐漸興起,但還未進行工業(yè)化生產(chǎn)。 本研究以酪蛋白為原料,通過篩選出最佳蛋白酶,并對酶解條
2、件進行優(yōu)化,制備出了具有較高抑制活性的ACE抑制肽;同時,通過超濾和凝膠層析對酶解產(chǎn)生的ACE抑制肽進行分離純化,并研究了具有最高ACE抑制活性的凝膠層析組分的多肽分子量分布和結(jié)構(gòu)初步推測。主要研究結(jié)果如下: 1、根據(jù)Cushman等的方法,對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽活性體外檢測方法進行了優(yōu)化,調(diào)整了反應體系中ACE用量,抵消了HHL、酶解物等對檢測結(jié)果的影響,驗證了方法的可靠性、重復性和精確性,確立了簡便可行的ACE抑制肽體外海
3、性檢測方法。 2、采用胃蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase五種蛋白酶,分別在各自最適條件下水解酪蛋白,通過比較水解過程和酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性,篩選出最佳蛋白酶Alcalase用于ACEIP制備。酪蛋白經(jīng)該酶水解5小時后,產(chǎn)物的ACE抑制活性達到最大,ACE抑制率為56.1±0.7%。 3、選取Alcalase水解酪蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEIP)。試驗中選擇溫度、酶與底物濃度比、底
4、物濃度、pH值等影響酶解因素的不同水平,以酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為指標,采用響應曲面法對酶解條件進行了優(yōu)化,并建立了酶解產(chǎn)物ACE抑制率的多元二次回歸模型方程。實驗表明,在溫度為60℃、酪蛋白濃度為7.11%、AlcalaSe和酪蛋白濃度比為7.83%、pH為7.0時,水解4小時所得酶解液ACE抑制率為70.5%,比蛋白酶篩選時所得抑制率提高了25.7%。酶解產(chǎn)物的IC50為0.54mg/mL。 4、在最佳條件下水解酪蛋白制備A
5、CEIP。選用分子截留量為3kDa的膜對酶解液進行超濾,然后經(jīng)SephadexG-15凝膠層析分離,并對其中一組分通過RP-HPLC和ESI-MS進行了分析。實驗結(jié)果表明,超濾使ACE抑制活性提高了8.8%,IC50下降了0.15mg/mL。超濾物經(jīng)凝膠層析后得到7個具有ACE抑制活性的組分,其中組分4的IC50為0.057mg/mL。采用RP-HPLC分析發(fā)現(xiàn),組分4成分已較為簡單,但還不是純的多肽。經(jīng)ESI-MS質(zhì)譜分析,測定其中主
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