酪蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備及分離純化研究.pdf

1、人體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性過高是引起高血壓的關(guān)鍵因素。ACE抑制肽能競爭性地與ACE活性中心結(jié)合，而抑制ACE的活性，起到降血壓的作用?，F(xiàn)有研究表明，這些多肽分子量大都在200-2000之間，且以2-10個氨基酸殘基組成的肽較為多見。近年來，國內(nèi)外利用食物蛋白獲取ACE抑制肽的研究廣泛開展，日本已有產(chǎn)品上市。目前，我國在這方面的研究逐漸興起，但還未進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。 本研究以酪蛋白為原料，通過篩選出最佳蛋白酶，并對酶解條

2、件進(jìn)行優(yōu)化，制備出了具有較高抑制活性的ACE抑制肽；同時，通過超濾和凝膠層析對酶解產(chǎn)生的ACE抑制肽進(jìn)行分離純化，并研究了具有最高ACE抑制活性的凝膠層析組分的多肽分子量分布和結(jié)構(gòu)初步推測。主要研究結(jié)果如下： 1、根據(jù)Cushman等的方法，對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽活性體外檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化，調(diào)整了反應(yīng)體系中ACE用量，抵消了HHL、酶解物等對檢測結(jié)果的影響，驗證了方法的可靠性、重復(fù)性和精確性，確立了簡便可行的ACE抑制肽體外海

3、性檢測方法。 2、采用胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase五種蛋白酶，分別在各自最適條件下水解酪蛋白，通過比較水解過程和酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性，篩選出最佳蛋白酶Alcalase用于ACEIP制備。酪蛋白經(jīng)該酶水解5小時后，產(chǎn)物的ACE抑制活性達(dá)到最大，ACE抑制率為56.1±0.7％。 3、選取Alcalase水解酪蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEIP)。試驗中選擇溫度、酶與底物濃度比、底

4、物濃度、pH值等影響酶解因素的不同水平，以酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法對酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了酶解產(chǎn)物ACE抑制率的多元二次回歸模型方程。實驗表明，在溫度為60℃、酪蛋白濃度為7.11％、AlcalaSe和酪蛋白濃度比為7.83％、pH為7.0時，水解4小時所得酶解液ACE抑制率為70.5％，比蛋白酶篩選時所得抑制率提高了25.7％。酶解產(chǎn)物的IC50為0.54mg/mL。 4、在最佳條件下水解酪蛋白制備A

5、CEIP。選用分子截留量為3kDa的膜對酶解液進(jìn)行超濾，然后經(jīng)SephadexG-15凝膠層析分離，并對其中一組分通過RP-HPLC和ESI-MS進(jìn)行了分析。實驗結(jié)果表明，超濾使ACE抑制活性提高了8.8％，IC50下降了0.15mg/mL。超濾物經(jīng)凝膠層析后得到7個具有ACE抑制活性的組分，其中組分4的IC50為0.057mg/mL。采用RP-HPLC分析發(fā)現(xiàn)，組分4成分已較為簡單，但還不是純的多肽。經(jīng)ESI-MS質(zhì)譜分析，測定其中主