東亞鉗蝎昆蟲毒素BmK IT的表達、純化以及性質(zhì)研究.pdf

1、蝎是一種以體軟昆蟲為食的動物，在長期的進化過程中為生存或防衛(wèi)的需要在其體內(nèi)產(chǎn)生了一系列毒素蛋白。這些活性多肽可選擇性地特異結(jié)合并調(diào)控可興奮細(xì)胞膜上的離子通道。它作為十分有價值的探針被廣泛應(yīng)用于相關(guān)靶離子通道分子調(diào)控機理的研究。同時，蝎毒素是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的極好模型。其中，蝎昆蟲神經(jīng)毒素(insect-selective scorpion neurotoxin)能夠?qū)Ｒ蛔饔糜诶ハx而對哺乳動物無害或毒性很小，因此可利用此類昆蟲特異

2、性的蝎神經(jīng)毒素開發(fā)新型生物殺蟲劑和開展抗蟲害轉(zhuǎn)基因植物的研究。
　　本課題組從主要分布于我國的東亞鉗蝎(Buthus martrnsii Karsch，BmK)中克隆到了一種興奮型昆蟲毒素基因(BmK IT)。該毒素蛋白含有69個氨基酸殘基和4對二硫鍵。本研究將BmK IT進行原核可溶性表達，并通過緩沖液的優(yōu)化、Intein自剪切、蛋白質(zhì)氧化重折疊等一系列方法獲得了大量的重組BmK IT，同時對利用大腸桿菌二硫鍵異構(gòu)酶DsbC催化

3、BmK IT折疊進行了初步研究。通過蟲試實驗、全細(xì)胞膜片鉗檢測、圓二色譜和結(jié)晶學(xué)等方法對其生理生化學(xué)性質(zhì)進行深入研究，獲得以下主要結(jié)果:
　　1、東亞鉗蝎昆蟲神經(jīng)毒素的可溶性表達、純化。將BmK IT的C端融合6個組氨酸殘基，通過pTWIN1表達系統(tǒng)獲得了Intein-BmK IT-his6融合蛋白，該融合蛋白N端為有助溶作用的Intein，C端為純化標(biāo)簽His6。通過在Ni-NTA親和柱上誘導(dǎo)Intein自剪切后洗脫得到相對純的

4、BmK IT，其中含有少量未剪切的融合蛋白。Superdex75凝膠過濾層析時發(fā)現(xiàn)，目的蛋白主要以多聚體的形式存在，少量為單體。我們將收集的單體進行BmK IT蟲試實驗，1.0和2.0 nmol/g BmK IT-his6的實驗組的半致死時間LT50分別為67±1h和47±1h，表明其具有良好的生物學(xué)活性。
　　2、重組東亞鉗蝎昆蟲毒素的氧化折疊。在DnaB-IT融合蛋白中的Intein DnaB部分是具有生物活性的，它們能夠在p

5、H6.5時有效地進行自剪切，但釋放的BmK IT快速聚合沉淀。對DnaB-IT融合蛋白的游離巰基進行測定，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)二硫鍵是在體外蛋白純化過程中形成的。因此，在E.coli中表達的目的蛋白處于未折疊的狀態(tài)，二硫鍵沒有完全形成，形成了“可溶性的包涵體”，它含有正確折疊的融合蛋白DnaB和未折疊或折疊錯誤的目的蛋白IT。隨后，在優(yōu)化的條件下，我們對重組BmK IT蛋白進行氧化重折疊，結(jié)果顯示，目的蛋白在柱上有效地進行重折疊，目的蛋白主要以單

6、體的形式存在。純化的BmK IT具有很高的熱穩(wěn)定性，在100℃下仍保持可溶。因此，我們設(shè)計了一個簡單而有效的BmKIT純化方法。表達的上清液首先進行IMAC(immobilized metal ion affinity chromatography)，洗滌雜蛋白后對目的蛋白進行氧化折疊，然后柱上誘導(dǎo)Intein自剪切，最后洗脫下的目的蛋白經(jīng)過80℃水浴20 min，離心獲得純的BmK IT。最終250ml培養(yǎng)液中能夠得到1.5 mg的目

7、的蛋白。
　　3、二硫鍵異構(gòu)酶DsbC催化下的BmK IT氧化折疊。從大腸桿菌中克隆了二硫鍵異構(gòu)酶DsbC，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pRSETc-DsbC，獲得了大量可溶的DsbC，實驗結(jié)果顯示，重組蛋白His6-DsbC以二聚體的形式存在，并且具有氧化還原活性和二硫鍵異構(gòu)酶活性。對DsbC在體外和體內(nèi)催化富含二硫鍵的蝎昆蟲毒素BmK IT的氧化折疊進行了初步研究。結(jié)果表明，rDsbC能夠加快BmK IT的折疊速度，但是需進一步對BmK

8、 IT和rDsbC的比例進行優(yōu)化。體內(nèi)將BmK IT與DsbC共表達實驗，目前尚未獲得預(yù)期效果，大量rIT仍然被吸附在柱材料中，共表達體系有待進一步改進。
　　4、對棉鈴蟲幼蟲神經(jīng)細(xì)胞的急性分離與體外培養(yǎng)條件進行摸索，為下一步利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對重組BmK IT作用于棉鈴蟲幼蟲神經(jīng)細(xì)胞的電壓門控鈉離子通道的電生理學(xué)活性分析奠定了基礎(chǔ)。
　　5、東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK IT蛋白的晶體生長條件的初步探索。使用HamptonRe