東亞鉗蝎毒素ITX對C57BL-6小鼠Lewis肺癌生長及免疫功能的影響.pdf

1、背景：東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch，BMK)經(jīng)中藥制作方式后作為傳統(tǒng)的中藥材在我國應(yīng)用已有上千年歷史，其主要藥用部位是蝎尾，藥效成分是蝎毒。傳統(tǒng)驗方中全蝎用于多種頑癥的治療。同時，祖國醫(yī)學(xué)認為腫瘤的根源是邪毒瘀結(jié)、毒陷邪深，非攻不克，故常用有毒之品，而全蝎具有攻堅蝕瘡、破瘀散結(jié)、消除腫塊的功效，因此常用于惡性腫瘤(癌癥)的治療。其實，中醫(yī)古典醫(yī)籍中并無現(xiàn)代醫(yī)學(xué)具體癌癥的確切稱謂，參照現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對具體癌癥的臨床表

2、現(xiàn)的描述，醫(yī)家將癌癥與中醫(yī)的某些癥候進行對應(yīng)，但這種認識方式具有一定的模糊性，鑒于此，為了驗證古代醫(yī)籍中關(guān)于蝎毒的攻毒散結(jié)的記載是否就是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所謂的抗腫瘤效應(yīng)，近年來，國內(nèi)許多科學(xué)工作者利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究方法對蝎毒的藥理作用進行了廣泛的研究。大量體內(nèi)實驗表明：蝎毒是一種高效低毒的生物制劑，對腫瘤兼有預(yù)防和治療的作用，甚至可以延長荷瘤小鼠的生存期，而且無毒性反應(yīng)；體外研究亦表明蝎毒對癌細胞有明顯的細胞毒性作用；一些研究人員更從免疫學(xué)的角

3、度探討了蝎毒的抗腫瘤效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)：蝎毒的某些組分在增強免疫功能的同時能夠降低腫瘤放化療的毒副作用。 ITX(Immunotoxin)就是利用凝膠過濾層析法(Gel-filtration Chromatography)從BMK粗毒中分離出來的純化成分，在前期研究中發(fā)現(xiàn)：低劑量(1μg/L、0.1μg/L)的ITX可以促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，還可使荷瘤小鼠分泌TNF-a增加；近期體內(nèi)外的實驗結(jié)果也顯示ITX能有效活化C57BL/6小鼠的

4、單核、B、NK和CD8+T細胞。其中，CD8+T和NK細胞本身就是清除機體腫瘤細胞的主要效應(yīng)細胞。而單核細胞作為專職的抗原呈遞細胞，它除了呈遞抗原給T細胞外，還可分泌IL-12等細胞因子，IL-12是一種在動物實驗中已證實的唯一可能具有抗瘤效應(yīng)的細胞因子，它可以誘導(dǎo)Th1細胞的分化，刺激T、NK細胞產(chǎn)生IFN-γ，進一步增強NK和CD8+T細胞的活性。加之傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代藥理對蝎毒抗腫瘤的文獻報道，本課題組設(shè)計了此研究方案。 目的

5、：本實驗運用現(xiàn)代細胞生物學(xué)技術(shù)觀察蝎素ITX對C57BL/6小鼠Lewis肺癌生長、發(fā)展和體內(nèi)免疫狀況的影響，驗證蝎毒是否真具有抗腫瘤的功效。 方法：將在體內(nèi)傳代保種的LLC(Lewis Lung Cancer)細胞接種到72只C57BL/6小鼠的右前腋下，在接種的第2天對小鼠進行分組，即空白組，模型組，rIL-2-ip組，ITX-ip組和ITX-iv組，其中rIL-2.ip組為陽性對照組。用藥組連續(xù)用藥16天，空白組和模型組給

6、予相同體積的生理鹽水。用藥期間觀察比較各組小鼠的一般狀態(tài)，監(jiān)測瘤質(zhì)量和瘤體積的變化。末次給藥后，對40只小鼠摘眼球取血，用血細胞分類計數(shù)法觀察小鼠外周血象的變化；利用流式細胞技術(shù)檢測外周血中免疫細胞(單核、NK、B和CD8+T細胞)的活化情況，了解荷瘤小鼠的免疫狀態(tài)；采用酶免法檢測外周血中TGFB1的分泌情況，分析TGFB1對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響；在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤和肺臟的炎性細胞的浸潤情況，探討免疫炎癥與腫瘤生長之間的關(guān)系。同時采

7、用免疫組化法檢測腫瘤組織中MHC-I、CD80、Fas和FasL分子的表達情況。余下的32只荷瘤小鼠進行生存期的觀察。 結(jié)果：1．一般狀態(tài)：ITX-iv組小鼠的生存期最短，生存質(zhì)量最差，其他用藥組小鼠未見明顯的藥物毒副反應(yīng)。2．腫瘤生長：在用ITX與rIL-2實驗組均看到接種的腫瘤生長更為快速，以ITX-ip組最明顯，尤其在接種的第14天以后。3．外周血象比較：由腫瘤競爭營養(yǎng)導(dǎo)致的紅細胞減少，以ITX-ip組表現(xiàn)得最為明顯，rI

8、L-2組次之，其余指標的組間比較并無統(tǒng)計學(xué)意義。4．免疫細胞表型分析：與空白組相比，后四組的單核細胞和活化的單核細胞的總量均在增多，而NK、B和CD8+T細胞和活化的B和CD8+T細胞的總量在減少。ITX-iv組的NK細胞的量明顯比模型組增加(P<0.05)；用藥組的活化的NK和B細胞均明顯比模型組多(P<0.05)。5．TGFB1含量比較：用藥組小鼠的TGF-B1的含量均比模型組高(P<0.05)。6.病理學(xué)結(jié)果：在荷瘤小鼠的腫瘤間質(zhì)

9、或肺泡間隔，可見不同程度的炎細胞的浸潤，其中用藥組的炎細胞數(shù)均比模型組增多(P<0.05)，ITX實驗組的炎細胞數(shù)比rIL-2組多(P<0.05)。7．免疫組化染色結(jié)果：組間MHC-1的表達并無明顯差異；而同樣是ITX，腹腔注射上調(diào)了CD80的表達，靜脈注射對CD80的影響不大；ITX-ip和rIL-2組Fas表達比模型組高(P<0.05)；ITX-ip組FasL表達比模型組高(P<0.05)，而rIL-2組FasL表達則比模型組低(P