東亞鉗蝎腹神經(jīng)索cDNA文庫的建立及其電壓門控鈉通道的表達(dá).pdf

1、東亞鉗蝎(Buthus martensi Karsch)是一種分布在我國淮河以北區(qū)域的古老蝎品種，其分泌的長鏈蝎毒素，大多被鑒定為特異性膜鈉通道調(diào)制劑。盡管蝎毒素對動物神經(jīng)元鈉通道具有明顯調(diào)制作用，但蝎自身神經(jīng)纖維上的鈉通道卻對其呈不敏感效應(yīng)。為解釋這一現(xiàn)象，解析內(nèi)在分子機(jī)制，并為深入探明鈉通道結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供更多的分子模板，本論文工作圍繞東亞鉗蝎電壓門控鈉通道的表達(dá)，利用SMART技術(shù)首次構(gòu)建了東亞鉗蝎腹部神經(jīng)索cDNA文庫，克隆

2、了黑腹果蠅鈉通道全長基因(para)，構(gòu)建了蝎-果蠅鈉通道嵌合體，并在爪蟾卵母細(xì)胞和HEK293-T細(xì)胞中進(jìn)行了外源表達(dá)及電生理功能鑒定。 1.東亞鉗蝎腹部神經(jīng)索cDNA文庫的建立以野生東亞鉗蝎的腹部神經(jīng)索為材料，運(yùn)用SMART技術(shù)，構(gòu)建了全長cDNA文庫。根據(jù)大腸桿菌XL1-Blue平皿測定和PCR快速鑒定表明，文庫的重組率為98.4％，初級庫容量為2.0×106pfu/ml，平均插入片段長度為1200bp，達(dá)到了用于EST

3、測序和目的基因分離篩選的建庫要求。 2.東亞鉗蝎電壓門控鈉通道的表達(dá)分別以我室獨(dú)有的蝎鈉通道重組質(zhì)粒和克隆得到的黑腹果蠅鈉通道基因?yàn)槟０?，?gòu)建了含有部分蝎鈉通道基因序列(BmNav1)以及部分果蠅鈉通道基因序列(para)的蝎-果蠅鈉通道嵌合體重組質(zhì)粒。所構(gòu)建兩個(gè)嵌合體：一個(gè)含有BmNav1跨膜結(jié)構(gòu)域I、II和para跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅲ、IV，并能在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)，被命名為PQ-pBSTA，經(jīng)雙電極記錄，能記錄到明顯鈉電流；另一