胚胎干細(xì)胞來(lái)源的角膜上皮樣細(xì)胞治療角膜緣干細(xì)胞缺乏的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞（human Embryonic Stem Cells，hESCs）向角膜上皮樣細(xì)胞分化，觀察分化細(xì)胞的生物學(xué)特性及其治療角膜緣干細(xì)胞缺乏的效果，并探討分化細(xì)胞的免疫原性及其移植后的免疫排斥反應(yīng)。
　　方法：通過(guò)小分子化合物誘導(dǎo)hESCs向角膜上皮細(xì)胞分化，免疫熒光染色、PCR檢測(cè)其上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，同時(shí)培養(yǎng)成體角膜緣上皮細(xì)胞（Limbal Epithelial Cells，LECs），以羊膜為載體制備重

2、組角膜上皮細(xì)胞膜片。建立新西蘭兔和食蟹猴的角膜緣干細(xì)胞缺乏模型，行重組角膜上皮細(xì)胞膜片移植，術(shù)后通過(guò)裂隙燈和印跡細(xì)胞學(xué)觀察其治療效果。通過(guò)全基因組芯片篩選hESCs分化細(xì)胞和LECs差異表達(dá)的基因，流式細(xì)胞檢測(cè)二者免疫相關(guān)分子的表達(dá)，體外T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其免疫原性，同時(shí)在體外模擬炎癥微環(huán)境觀察對(duì)細(xì)胞免疫原性的影響，重組角膜上皮細(xì)胞膜片移植后觀察免疫排斥反應(yīng)，并用免疫熒光染色觀察免疫細(xì)胞。
　　結(jié)果：hESCs分

3、化細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)與角膜緣干細(xì)胞相似，并表達(dá)角膜緣干細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞的標(biāo)記物，其多能性標(biāo)志物為陰性，并能在去上皮羊膜上形成復(fù)層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，重組角膜上皮細(xì)胞膜片移植到角膜緣干細(xì)胞缺乏的新西蘭兔和食蟹猴體內(nèi)后，能夠顯著改善眼表情況并長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定。相比于LECs，hESCs分化細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的表達(dá)顯著下調(diào)，其MHC分子低表達(dá)，在體外不易引起T細(xì)胞增殖也不易被NK細(xì)胞殺傷，并且這些特性不受炎癥微環(huán)境的影響，hESCs分化細(xì)胞移植到體內(nèi)后未