兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療角膜緣干細(xì)胞缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探索體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到堿燒傷的兔角膜表面后，細(xì)胞的存活、遷移和分化情況，探討間充質(zhì)干細(xì)胞在體外向角膜上皮細(xì)胞橫向分化的可能性，為眼科臨床治療角膜上皮細(xì)胞和角膜緣干細(xì)胞缺損或功能紊亂提供新思路。 方法：18只新西蘭兔(2.0～2.5kg)麻醉后，每只選左眼無菌條件下用lmol/L NaOH浸透的環(huán)型濾紙片與角膜密切接觸1min建立角膜堿燒傷動(dòng)物模型。人羊膜經(jīng)胰蛋白酶．依地

2、酸處理去除其表層細(xì)胞。抽取兔髂骨骨髓，置于等體積的兔單核細(xì)胞分離液(密度1.094g/ml)上，2500r/min離心25min，吸取含單個(gè)核細(xì)胞的乳白色液體層，加入含體積分?jǐn)?shù)為10﹪胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，觀察并繪制細(xì)胞生長曲線。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第三代細(xì)胞的CD29、CD45、CD34表達(dá)情況。將第三代細(xì)胞接種于鋪有羊膜基質(zhì)的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，移植術(shù)前48小時(shí)將5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)加入到培養(yǎng)基中(終濃度為1

3、0μmol/L)。將18只堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺損模型兔隨機(jī)分為對(duì)照組、單純羊膜基質(zhì)移植組和兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組，每組6只兔子6只眼。模型建立1個(gè)月后行移植手術(shù)，并對(duì)術(shù)后的角膜進(jìn)行觀察。術(shù)后4周，取各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物角膜行石蠟切片，蘇木精一伊紅(HE)染色觀察角膜組織結(jié)構(gòu)的變化，并進(jìn)行BrdU和細(xì)胞角蛋白AE5單克隆抗體免疫組化染色以觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活以及向角膜上皮細(xì)胞方向分化的情況。 結(jié)果：由兔單核細(xì)胞分離液獲取的骨髓單

4、個(gè)核細(xì)胞，呈圓形，24h大量貼壁，3d后進(jìn)入快速增殖期，呈梭形并聚集成細(xì)胞集落，12d左右融合達(dá)80﹪～90﹪。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，此次培養(yǎng)的第3代細(xì)胞高表達(dá)CD29，不表達(dá)CD34和CD45，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。兔眼經(jīng)環(huán)行濾紙片堿燒傷后，角膜出現(xiàn)混濁、新生血管化和瘢痕化。印跡細(xì)胞學(xué)檢查提示角膜表層結(jié)膜化。兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植術(shù)后兔角膜基本保持透明，新生血管細(xì)小，角膜中央無新生血管；角膜病理學(xué)檢查可見與正常角膜類似的結(jié)構(gòu)特

5、點(diǎn)，上皮細(xì)胞排列整齊，與基質(zhì)層連接緊密，偶見炎癥細(xì)胞，未見明顯杯狀細(xì)胞和新生血管；角膜免疫組化染色結(jié)果顯示：BrdU陽性，AE5陽性。單純羊膜基質(zhì)移植術(shù)后兔角膜中度混濁，新生血管接近角膜中央；角膜病理學(xué)檢查可見排列不規(guī)則的復(fù)層上皮細(xì)胞間夾雜少量杯狀細(xì)胞，角膜基質(zhì)層可見炎癥細(xì)胞和少量新生血管；角膜免疫組化染色結(jié)果顯示：BrdU陰性，AE5陰性?？瞻讓?duì)照組兔角膜明顯混濁，角膜中央部大量的新生血管；角膜病理學(xué)檢查可見角膜表層細(xì)胞增多、排列不規(guī)

6、則，并且可見大量杯狀細(xì)胞侵入，角膜基質(zhì)層膠原纖維排列疏松紊亂，有大量炎癥細(xì)胞和新生血管浸潤；角膜免疫組化染色結(jié)果顯示：BrdU陰性，AE5陰性。結(jié)論：采用兔單核細(xì)胞分離液密度梯度離心和貼壁篩選相結(jié)合的方法可以獲取純度較高的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過堿溶液環(huán)形濾紙片燒傷的方法可以建立角膜緣干細(xì)胞缺損的動(dòng)物模型。以羊膜基質(zhì)為載體移植至兔角膜基質(zhì)層上的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可存活并增殖分化為角膜上皮細(xì)胞或角膜上皮細(xì)胞樣細(xì)胞而發(fā)揮功能，在治療角膜堿