誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為角膜上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、經(jīng)初步誘導(dǎo)后，于活體角膜基質(zhì)板層及基質(zhì)細(xì)胞組成的微環(huán)境上觀察鼠胚胎干細(xì)胞分化為角膜上皮細(xì)胞的情況。探索在體角膜基質(zhì)板層及基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的微環(huán)境誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為角膜上皮細(xì)胞的可能性及誘導(dǎo)條件，為解決構(gòu)建組織工程角膜治療嚴(yán)重眼表疾病的種子細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題提供新途徑。 方法： 1．培養(yǎng)鼠胚胎干細(xì)胞(轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的BALB/c小鼠胚胎干細(xì)胞系GFP-ESC)，脫去飼養(yǎng)層培養(yǎng)兩代后使用視黃酸(RA)初步誘導(dǎo)。 2．利用庚

2、醇制作新西蘭白兔角膜上皮缺損模型，將經(jīng)視黃酸(RA)初步誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞(GFP-ESC)移植到角膜基質(zhì)板層及基質(zhì)細(xì)胞上，利用基質(zhì)板層誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為角膜上皮的實(shí)驗(yàn)研究及基質(zhì)細(xì)胞形成的微環(huán)境促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的定向分化，增加GFP-ESC向角膜上皮細(xì)胞的分化效率；對(duì)側(cè)眼以生理鹽水做對(duì)照，分別于移植12h，24h，4w,8w后行裂隙燈檢查、角膜熒光素染色，取材進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、組織切片熒光照相、免疫組織化學(xué)檢查GFP、AE5(

3、角蛋白CK3/12)的表達(dá)。 結(jié)果： 1．胚胎干細(xì)胞(GFP-ESC)在飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)良好，呈克隆樣生長(zhǎng)，表達(dá)較強(qiáng)的綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記，撤去飼養(yǎng)層培養(yǎng)兩代后生長(zhǎng)情況及標(biāo)記蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。 2．利用庚醇制作新西蘭白兔角膜上皮缺損模型：切片HE染色示無(wú)角膜上皮細(xì)胞殘留，角膜基質(zhì)面光滑，基質(zhì)板層及基質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整規(guī)則。 3．胚胎干細(xì)胞(GFP-ESC)眼表移植12h、24h后取材切片行蘇木素．伊紅(H

4、E)染色、組織切片熒光照相。HE染色示胚胎干細(xì)胞(GFP-ESC)呈單層貼附于角膜基質(zhì)板層上；熒光照片亦顯示胚胎干細(xì)胞呈單層貼附于角膜基質(zhì)板層上，細(xì)胞GFP陽(yáng)性。 4．胚胎干細(xì)胞(GFP-ESC)眼表移植4周、8周后行裂隙燈檢查，眼表上皮化良好：熒光素不著染、角膜透明、新生血管少；組織切片AE5染色陽(yáng)性，上皮和基底膜結(jié)合緊密，上面4～6層復(fù)層細(xì)胞，細(xì)胞GFP陽(yáng)性，與正常角膜有相似組織學(xué)結(jié)構(gòu)，無(wú)結(jié)膜細(xì)胞侵入，無(wú)畸胎瘤形成。

5、 結(jié)論： 1．使用庚醇制作新西蘭白兔角膜上皮缺損模型是一種簡(jiǎn)單、易行、有效的方法，庚醇處理后的角膜無(wú)上皮細(xì)胞殘留，基質(zhì)面光滑，基質(zhì)板層及基質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整規(guī)則，適于干細(xì)胞貼附； 2．通過(guò)視黃酸(RA)初步誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(GFP-ESC)后移植到角膜基質(zhì)及其細(xì)胞上，利用角膜基質(zhì)及其細(xì)胞形成的微環(huán)境促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的定向分化，成功誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為角膜上皮樣細(xì)胞，增加了其向角膜上皮細(xì)胞的分化效率。胚胎干細(xì)胞與角膜基質(zhì)結(jié)合緊密，