人羊膜上皮細(xì)胞移植治療角膜緣干細(xì)胞缺損的實驗研究.pdf

1、目的角膜緣干細(xì)胞缺損時，角膜上皮細(xì)胞不能自我更新，結(jié)膜上皮侵入角膜表面，這種結(jié)膜化的過程會使角膜上皮變得異常且不規(guī)則，并伴有繼發(fā)的新生血管化，持續(xù)的上皮缺損，基質(zhì)潰瘍，瘢痕化，潛在的穿孔，慢性疼痛及視力喪失。角膜緣干細(xì)胞缺損的治療非常棘手。以抑制炎癥反應(yīng)、防止感染、減少瞼球粘連等為目的的保守療法和傳統(tǒng)的穿透或板層角膜移植等手術(shù)治療方法的效果均很差。角膜緣干細(xì)胞移植被認(rèn)為是一種促進(jìn)角膜損傷愈合，穩(wěn)定角膜表面，修復(fù)角膜上皮糜爛和持續(xù)性上皮缺

2、損，減少角膜新生血管侵入，阻止假性胬肉形成，增進(jìn)視力，提高角膜移植成功率的有效方法。自體角膜緣移植不存在免疫排斥反應(yīng)，術(shù)后效果好，但只適用于單眼角膜緣受損或雙眼局限性受損的患者，臨床應(yīng)用有一定的局限性。同種異體角膜緣移植存在免疫排斥反應(yīng)，常致手術(shù)失敗。 羊膜上皮細(xì)胞(Amniotic epithetical cells)是胚胎發(fā)育的早期產(chǎn)物，所以其中可能含有多潛能干細(xì)胞。保存羊膜的上皮細(xì)胞已經(jīng)死亡，新鮮羊膜的上皮細(xì)胞與基底膜結(jié)合

3、緊密，兩者都不易發(fā)揮其干細(xì)胞的功能，于是我們將人羊膜上皮細(xì)胞分離并于體外進(jìn)行大量增殖培養(yǎng)，并以去上皮羊膜為載體移植治療兔角膜堿燒傷所致的角膜緣干細(xì)胞缺損，通過與單純?nèi)ド掀ぱ蚰ひ浦脖容^治療效果，探討該手術(shù)方法的安全性和有效性，為嚴(yán)重角膜緣干細(xì)胞缺損的臨床治療提供新的思路。 方法堿燒傷模型的制作方法參照’Fseng等人建立的方法進(jìn)行改進(jìn)，通過板層切除角膜緣聯(lián)合NaOH燒傷角膜來達(dá)到制作目的。羊膜經(jīng)EDTA處理后去除其上皮細(xì)胞。分離，

4、去除殘留的絨毛膜，PBS洗盡血跡后用0.125﹪胰酶(typsine)37℃消化15分鐘，重復(fù)4次，1000rpm離心6分鐘收集羊膜上皮細(xì)胞，用PBS洗三次后接種在含DEME培養(yǎng)皿中，于3 7℃含5﹪二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)兩周后接種于去上皮羊膜上，常規(guī)培養(yǎng)兩周后行移植手術(shù)。將單眼堿燒傷模型兔18只隨機(jī)分為對照組(control group)，單純羊膜移植組(AM group)和人羊膜上皮細(xì)胞羊膜移植組(AM+cell grou

5、p)，每組6只兔6眼，移植手術(shù)于燒傷后四周進(jìn)行，并對治療后的角膜進(jìn)行裂隙燈觀察，病理學(xué)和免疫組化檢測。 結(jié)果消化、分離的HAECs于2-3天內(nèi)貼壁，15×15cm<'2>大小的羊膜大約可以收獲1×10<'6>個細(xì)胞。貼壁生長的羊膜上皮細(xì)胞一般成簇生長，呈圓形、多角形，核較大，胞漿中含有特征性的空泡狀的脂肪滴。2—3周傳代一次．人羊膜上皮細(xì)胞羊膜移植組治療后角膜基本保持透明，新生血管細(xì)小，未見結(jié)膜上皮長入；病理學(xué)檢查可見與正常角膜

6、類似的復(fù)層上皮，未見明顯的杯狀細(xì)胞和新生血管；AE-5染色陽性。單純?nèi)ド掀ぱ蚰ひ浦仓委熀蠼悄せ鞚?，結(jié)膜上皮長入，新生血管較粗大多見；病理學(xué)檢查可見排列不規(guī)則的復(fù)層上皮細(xì)胞，夾雜較多杯狀細(xì)胞，可見炎性細(xì)胞，紅細(xì)胞和新生血管，AE-5染色陰性。對照組大部分角膜上皮脫落，杯狀細(xì)胞彌漫分布，炎性細(xì)胞浸潤，大量新生血管向角膜中央生長，AE-5陰性。 結(jié)論采用消化培養(yǎng)法可獲得人羊膜上皮細(xì)胞。通過板層切除角膜緣聯(lián)合氫氧化鈉燒傷角膜可以建立角膜