胚胎干細胞條件培養(yǎng)液促進兔角膜上皮細胞長期增殖的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 本研究旨在探討胚胎干細胞條件培養(yǎng)液對兔角膜旁中央部上皮細胞生物學(xué)特性(如形態(tài)、增殖、CFE和細胞表型等)和功能(如復(fù)層)的影響,以期建立一種利用少量自身細胞獲得大量種子細胞的培養(yǎng)體系,從而滿足組織工程器官構(gòu)建和細胞治療的需要。
　　 方法：
　　 利用組織塊法取材并培養(yǎng)兔周邊部角膜上皮細胞,設(shè)定對照Ⅰ組為角膜上皮常規(guī)培養(yǎng)液(高糖DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基)培養(yǎng)的細胞；對照Ⅱ組為上述培養(yǎng)液添加40％小鼠ES

2、細胞培養(yǎng)液(高糖Knock out DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基)培養(yǎng)的細胞；實驗組為角膜上皮常規(guī)培養(yǎng)液添加40％小鼠ES細胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)的細胞。比較各組細胞的連續(xù)傳代能力；倒置相差顯微鏡比較各組細胞的形態(tài)和生長情況;流式細胞儀測定細胞大小和死活染色分析;利用Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)板比較各組細胞的粘附能力；MTT法測定生長曲線;Giemsa染色觀察細胞的克隆形成能力；利用免疫熒光方法和RT-PCR檢測角膜上皮細胞標記物(CK3/CK12、P63和

3、ABCG2)的表達情況；秋水仙素法測定核型,注射裸鼠觀察細胞致瘤性；氣-液刺激促進復(fù)層形成,HE染色觀察復(fù)層形成情況,掃描電鏡觀察表面微絨毛情況,免疫組化檢測復(fù)層上皮角膜上皮標記物-CK3/CK12、p63、ABCG2及細胞問、細胞-基質(zhì)問連接-Desmocollin3、Occludin、Integrin beta4和基底膜成分-Ⅳ Collagen表達。
　　 結(jié)果：
　　 本研究成功建立了一種利用胚胎干細胞微環(huán)境促進

4、細胞增殖的培養(yǎng)體系,研究結(jié)果顯示:經(jīng)ES條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的兔角膜上皮細胞具有高度的增殖活性,22周內(nèi)在體外連續(xù)傳代超過55代,而兩個對照組在體外生長均未達3代；實驗組細胞形態(tài)更致密、均一,呈現(xiàn)典型的鋪路石狀,具有接觸抑制性,當撤除ESC-CM后,處理組細胞失去已獲得的增殖能力,細胞傳代不能超過5代。實驗組P1和P20細胞直徑在17-23μm的細胞比例顯著(P<0.05)高于兩個對照組,當撤除ESC-CM后,直徑17-23μm的細胞比例顯著

5、下降,而直徑24-30μm的細胞比例顯著增加。實驗組細胞粘附能力強,貼壁細胞死亡率低；先于對照組進入對數(shù)生長期,細胞倍增時間短；克隆形成能力更強,形成的克隆大,細胞數(shù)量多；表達角膜上皮細胞標記物,核型正常,不致瘤。經(jīng)過ESC-CM處理的兔角膜上皮細胞在氣一液界面刺激下可以形成復(fù)層上皮結(jié)構(gòu),其表面具有豐富的微絨毛,角膜上皮特異性標記物-CK3/CK12、細胞連接Desmocollin3、Occludin、Integrin beta4和基底