姜黃素在炎癥誘導(dǎo)的食管鱗癌中的化學(xué)預(yù)防作用.pdf

1、目的：
　　食管癌位于全球癌癥死亡率中第六，其中，我國(guó)的中北部是食管癌高發(fā)地區(qū)之一。90％以上的食管癌類型為鱗癌，雖然腫瘤的治療技術(shù)在不斷地提高，但食管鱗癌的五年生存率仍低于30%。食管鱗癌的發(fā)病原因多種多樣，它的發(fā)生機(jī)制也是錯(cuò)綜復(fù)雜，有許多研究發(fā)現(xiàn)它與多種信號(hào)通路的激活有關(guān)，但其具體的機(jī)制現(xiàn)在尚未研究清楚。近年來(lái)研究表明，腫瘤的發(fā)生與慢性感染和炎癥有密切關(guān)系。因此，研究學(xué)者通過(guò)不斷尋求設(shè)計(jì)新的方法了解食管鱗癌的分子機(jī)制，從而提高

2、其臨床治療效果和預(yù)后，以及改善耐藥性。目前，腫瘤的治療方法包括手術(shù)、化療、放射治療以及生物治療，可是這幾種方法都存在一定的局限性，隨著人們對(duì)腫瘤病因以及發(fā)病機(jī)制的不斷深入了解，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤是可以預(yù)防的。目前，化學(xué)預(yù)防在腫瘤中的應(yīng)用逐漸受到廣泛的關(guān)注，它是指利用天然的或者合成的藥物提前干預(yù)腫瘤的進(jìn)展，并且化學(xué)預(yù)防手段可以阻斷腫瘤中多個(gè)信號(hào)通路的激活。姜黃素（Curcumin）是姜黃科植物根莖中的天然提取物，它不僅具有抗氧化、抗炎的功效

3、，還能夠調(diào)節(jié) NF-κB、MAPK等信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　近年來(lái)，有許多研究發(fā)現(xiàn) JAK-STAT信號(hào)通路在多種腫瘤中扮演著重要角色，STATs可以被多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和一些激素所激活，STAT3屬于STATs蛋白家族中的一員。在正常細(xì)胞中，STAT3的激活是短暫且可逆的，目前，已有許多研究發(fā)現(xiàn)，在許多惡性腫瘤中檢測(cè)到STAT3的持續(xù)激活，活化的STAT3可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管

4、生成，干擾腫瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤免疫反應(yīng)，也與腫瘤的預(yù)后有關(guān)等。因此，阻斷STAT3的功能有望為腫瘤靶向治療和化學(xué)預(yù)防提供一個(gè)新的重要方向。本文通過(guò)兩部分來(lái)研究姜黃素在炎癥誘導(dǎo)的食管鱗癌中的化學(xué)預(yù)防作用，利用siRNA下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中STAT3的表達(dá)，探究STAT3在食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用，體外選取EC9706和TE13食管鱗癌細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，評(píng)價(jià)姜黃素能否通過(guò)STAT3信號(hào)通路對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、克隆形成能力、凋亡及周期產(chǎn)生影響

5、；IL-6是STAT3的一個(gè)激活因子，我們用IL-6作用于EC9706和TE13細(xì)胞并聯(lián)合應(yīng)用姜黃素，評(píng)價(jià)姜黃素是否可以阻斷因IL-6刺激以后的STAT3的組成型激活；體內(nèi)建立人源性食管鱗癌移植瘤模型（PDX模型），評(píng)價(jià)姜黃素在體內(nèi)對(duì) STAT3不同激活狀態(tài)的腫瘤的治療效果，為STAT3作為食管鱗癌的分子治療靶點(diǎn)，以及姜黃素能否成為炎癥誘導(dǎo)的食管鱗癌的化學(xué)預(yù)防藥物提供理論依據(jù)。
　　第一部分：姜黃素通過(guò)下調(diào) STAT3的活性從而抑

6、制食管鱗癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)凋亡
　　方法：
　　1.利用STAT3 siRNA作用于EC9706細(xì)胞48h，檢測(cè)下調(diào)STAT3后細(xì)胞周期及凋亡情況。
　　2. CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：不同濃度姜黃素（0、25、50、100μM）分別作用于食管鱗癌細(xì)胞EC9706和TE1324和48h，測(cè)定食管鱗細(xì)胞的吸光度值，從而計(jì)算出細(xì)胞的生存率，選取細(xì)胞生存率為80%左右的藥物濃度為細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的最大藥物濃度。
　　3. C

7、CK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：不同濃度姜黃素（0、4、8、12、16μM）分別作用于食管鱗癌細(xì)胞EC9706和TE13不同時(shí)間（0、24、48、72、96h），測(cè)定食管鱗癌細(xì)胞在姜黃素作用下的吸光度值，評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)：評(píng)價(jià)不同濃度姜黃素（0、4、8、12、16μM）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　5.細(xì)胞凋亡和周期實(shí)驗(yàn)：用Annexin V-FITC、Hoechst33342及D

8、API染色，檢測(cè)不同濃度姜黃素（0、4、8、12、16μM）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞EC9706和TE13凋亡及周期的影響
　　6.Western blotting檢測(cè)姜黃素作用于食管鱗癌細(xì)胞EC9706和TE13后STAT3信號(hào)通路的變化；同樣，利用該方法檢測(cè)姜黃素對(duì)IL-6刺激EC9706和TE13細(xì)胞后STAT3信號(hào)通路的影響。
　　結(jié)果：
　　1.結(jié)果顯示，siRNA-1878和siRNA-1272轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞后

9、，與對(duì)照組相比，凋亡的細(xì)胞以及S期細(xì)胞明顯增多。
　　2.不同濃度姜黃素（0、25、50、100μM）分別作用于EC9706和TE13細(xì)胞24、48h后，繪制細(xì)胞毒性結(jié)果曲線圖，結(jié)果顯示，細(xì)胞生存率為80%左右的藥物濃度為20μM。
　　3.不同濃度姜黃素（0、4、8、12、16μM）分別作用于EC9706和TE13細(xì)胞0、24、48、72、96h后，結(jié)果顯示，姜黃素能夠抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，且濃度越大，細(xì)胞增殖的能力越小

10、。
　　4.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素可以抑制EC9706細(xì)胞的克隆形成，且姜黃素濃度越大，克隆數(shù)量越少。
　　5.細(xì)胞凋亡和周期結(jié)果顯示，姜黃素可以誘導(dǎo)EC9706和TE13細(xì)胞的凋亡，濃度越高，誘導(dǎo)作用越明顯；姜黃素可以阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展，使S期細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈濃度依賴性。
　　6.Western blotting結(jié)果顯示，姜黃素可以抑制EC9706和TE13細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)，同時(shí)還能夠抑制i

11、NOS和p-NF-κB的表達(dá)，同時(shí)，姜黃素也可以抑制由IL-6引起的p-STAT3的活化。
　　第二部分：姜黃素通過(guò)下調(diào) STAT3的活性從而抑制人源性食管鱗癌移植瘤（PDX）的生長(zhǎng)
　　方法：
　　1.選取多種人食管鱗癌組織，提取蛋白后用Western blotting檢測(cè)其p-STAT3的表達(dá)情況。
　　2.選取組織 EG37（p-STAT3高表達(dá)）和 EG2（p-STAT3低表達(dá)），構(gòu)建 PDX模型，利用該

12、模型評(píng)價(jià)姜黃素的抗癌和預(yù)防效果。
　　3.治療結(jié)束后，將各組瘤體剝出，提取蛋白后用Western blotting檢測(cè)瘤體中p-STAT3及其調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　4.采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組瘤體中STAT3信號(hào)通路以及Caspase-3的表達(dá)水平。
　　5.用HE染色觀察各組瘤體中細(xì)胞的分化、壞死情況。
　　6. TUNEL法觀察經(jīng)姜黃素治療后，組織細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.

13、在EG37和EG2 PDX模型中，與對(duì)照組相比，姜黃素可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，預(yù)防組比治療組的抑制效果更加明顯，且在這兩個(gè)模型中，姜黃素的抗癌效果在STAT3高活化EG37組中更加顯著。
　　2.Western blotting結(jié)果顯示，在姜黃素治療組和預(yù)防組中，p-STAT3、iNOS、p-NF-κB和Cox2的表達(dá)水平降低。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示，姜黃素治療組和預(yù)防組中，p-STAT3和Cox2的表達(dá)水平降低，且Casp

14、ase-3的表達(dá)水平升高。
　　4. TUNEL結(jié)果顯示，在姜黃素治療組和預(yù)防組中，瘤體組織細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增多。
　　結(jié)論：
　　1.體外研究表明，姜黃素能夠阻斷食管鱗癌細(xì)胞中 STAT3的活化，抑制 IL-6激活的STAT3，以及下調(diào)p-NF-κB和iNOS的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖、克隆形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期。
　　2.人食管鱗癌PDX模型體內(nèi)結(jié)果顯示，姜黃素通過(guò)阻斷STAT3的組成型激活從而抑