姜黃素在炎癥誘導的食管鱗癌中的化學預防作用.pdf

1、目的：
　　食管癌位于全球癌癥死亡率中第六，其中，我國的中北部是食管癌高發(fā)地區(qū)之一。90％以上的食管癌類型為鱗癌，雖然腫瘤的治療技術在不斷地提高，但食管鱗癌的五年生存率仍低于30%。食管鱗癌的發(fā)病原因多種多樣，它的發(fā)生機制也是錯綜復雜，有許多研究發(fā)現(xiàn)它與多種信號通路的激活有關，但其具體的機制現(xiàn)在尚未研究清楚。近年來研究表明，腫瘤的發(fā)生與慢性感染和炎癥有密切關系。因此，研究學者通過不斷尋求設計新的方法了解食管鱗癌的分子機制，從而提高

2、其臨床治療效果和預后，以及改善耐藥性。目前，腫瘤的治療方法包括手術、化療、放射治療以及生物治療，可是這幾種方法都存在一定的局限性，隨著人們對腫瘤病因以及發(fā)病機制的不斷深入了解，許多學者發(fā)現(xiàn)腫瘤是可以預防的。目前，化學預防在腫瘤中的應用逐漸受到廣泛的關注，它是指利用天然的或者合成的藥物提前干預腫瘤的進展，并且化學預防手段可以阻斷腫瘤中多個信號通路的激活。姜黃素（Curcumin）是姜黃科植物根莖中的天然提取物，它不僅具有抗氧化、抗炎的功效

3、，還能夠調(diào)節(jié) NF-κB、MAPK等信號通路，從而抑制腫瘤細胞的增殖和促進腫瘤細胞的凋亡。
　　近年來，有許多研究發(fā)現(xiàn) JAK-STAT信號通路在多種腫瘤中扮演著重要角色，STATs可以被多種細胞因子、生長因子和一些激素所激活，STAT3屬于STATs蛋白家族中的一員。在正常細胞中，STAT3的激活是短暫且可逆的，目前，已有許多研究發(fā)現(xiàn)，在許多惡性腫瘤中檢測到STAT3的持續(xù)激活，活化的STAT3可以促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管

4、生成，干擾腫瘤細胞凋亡和抗腫瘤免疫反應，也與腫瘤的預后有關等。因此，阻斷STAT3的功能有望為腫瘤靶向治療和化學預防提供一個新的重要方向。本文通過兩部分來研究姜黃素在炎癥誘導的食管鱗癌中的化學預防作用，利用siRNA下調(diào)食管鱗癌細胞中STAT3的表達，探究STAT3在食管鱗癌細胞生長中的作用，體外選取EC9706和TE13食管鱗癌細胞系為實驗對象，評價姜黃素能否通過STAT3信號通路對食管鱗癌細胞的增殖、克隆形成能力、凋亡及周期產(chǎn)生影響

5、；IL-6是STAT3的一個激活因子，我們用IL-6作用于EC9706和TE13細胞并聯(lián)合應用姜黃素，評價姜黃素是否可以阻斷因IL-6刺激以后的STAT3的組成型激活；體內(nèi)建立人源性食管鱗癌移植瘤模型（PDX模型），評價姜黃素在體內(nèi)對 STAT3不同激活狀態(tài)的腫瘤的治療效果，為STAT3作為食管鱗癌的分子治療靶點，以及姜黃素能否成為炎癥誘導的食管鱗癌的化學預防藥物提供理論依據(jù)。
　　第一部分：姜黃素通過下調(diào) STAT3的活性從而抑

6、制食管鱗癌細胞的增殖及促進凋亡
　　方法：
　　1.利用STAT3 siRNA作用于EC9706細胞48h，檢測下調(diào)STAT3后細胞周期及凋亡情況。
　　2. CCK-8細胞毒性實驗：不同濃度姜黃素（0、25、50、100μM）分別作用于食管鱗癌細胞EC9706和TE1324和48h，測定食管鱗細胞的吸光度值，從而計算出細胞的生存率，選取細胞生存率為80%左右的藥物濃度為細胞增殖實驗的最大藥物濃度。
　　3. C

7、CK-8細胞增殖實驗：不同濃度姜黃素（0、4、8、12、16μM）分別作用于食管鱗癌細胞EC9706和TE13不同時間（0、24、48、72、96h），測定食管鱗癌細胞在姜黃素作用下的吸光度值，評價姜黃素對細胞增殖能力的影響。
　　4.軟瓊脂克隆形成實驗：評價不同濃度姜黃素（0、4、8、12、16μM）對食管鱗癌細胞克隆形成能力的影響。
　　5.細胞凋亡和周期實驗：用Annexin V-FITC、Hoechst33342及D

8、API染色，檢測不同濃度姜黃素（0、4、8、12、16μM）對食管鱗癌細胞EC9706和TE13凋亡及周期的影響
　　6.Western blotting檢測姜黃素作用于食管鱗癌細胞EC9706和TE13后STAT3信號通路的變化；同樣，利用該方法檢測姜黃素對IL-6刺激EC9706和TE13細胞后STAT3信號通路的影響。
　　結果：
　　1.結果顯示，siRNA-1878和siRNA-1272轉(zhuǎn)染EC9706細胞后

9、，與對照組相比，凋亡的細胞以及S期細胞明顯增多。
　　2.不同濃度姜黃素（0、25、50、100μM）分別作用于EC9706和TE13細胞24、48h后，繪制細胞毒性結果曲線圖，結果顯示，細胞生存率為80%左右的藥物濃度為20μM。
　　3.不同濃度姜黃素（0、4、8、12、16μM）分別作用于EC9706和TE13細胞0、24、48、72、96h后，結果顯示，姜黃素能夠抑制食管鱗癌細胞的增殖，且濃度越大，細胞增殖的能力越小

10、。
　　4.軟瓊脂克隆形成實驗結果表明，姜黃素可以抑制EC9706細胞的克隆形成，且姜黃素濃度越大，克隆數(shù)量越少。
　　5.細胞凋亡和周期結果顯示，姜黃素可以誘導EC9706和TE13細胞的凋亡，濃度越高，誘導作用越明顯；姜黃素可以阻滯細胞周期的進展，使S期細胞數(shù)量明顯增多，呈濃度依賴性。
　　6.Western blotting結果顯示，姜黃素可以抑制EC9706和TE13細胞中p-STAT3的表達，同時還能夠抑制i

11、NOS和p-NF-κB的表達，同時，姜黃素也可以抑制由IL-6引起的p-STAT3的活化。
　　第二部分：姜黃素通過下調(diào) STAT3的活性從而抑制人源性食管鱗癌移植瘤（PDX）的生長
　　方法：
　　1.選取多種人食管鱗癌組織，提取蛋白后用Western blotting檢測其p-STAT3的表達情況。
　　2.選取組織 EG37（p-STAT3高表達）和 EG2（p-STAT3低表達），構建 PDX模型，利用該

12、模型評價姜黃素的抗癌和預防效果。
　　3.治療結束后，將各組瘤體剝出，提取蛋白后用Western blotting檢測瘤體中p-STAT3及其調(diào)節(jié)的相關蛋白的表達情況。
　　4.采用免疫組織化學法檢測各組瘤體中STAT3信號通路以及Caspase-3的表達水平。
　　5.用HE染色觀察各組瘤體中細胞的分化、壞死情況。
　　6. TUNEL法觀察經(jīng)姜黃素治療后，組織細胞的凋亡情況。
　　結果：
　　1.

13、在EG37和EG2 PDX模型中，與對照組相比，姜黃素可以抑制腫瘤的生長，預防組比治療組的抑制效果更加明顯，且在這兩個模型中，姜黃素的抗癌效果在STAT3高活化EG37組中更加顯著。
　　2.Western blotting結果顯示，在姜黃素治療組和預防組中，p-STAT3、iNOS、p-NF-κB和Cox2的表達水平降低。
　　3.免疫組化結果顯示，姜黃素治療組和預防組中，p-STAT3和Cox2的表達水平降低，且Casp

14、ase-3的表達水平升高。
　　4. TUNEL結果顯示，在姜黃素治療組和預防組中，瘤體組織細胞的凋亡數(shù)量明顯增多。
　　結論：
　　1.體外研究表明，姜黃素能夠阻斷食管鱗癌細胞中 STAT3的活化，抑制 IL-6激活的STAT3，以及下調(diào)p-NF-κB和iNOS的表達，從而抑制細胞的增殖、克隆形成，誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期。
　　2.人食管鱗癌PDX模型體內(nèi)結果顯示，姜黃素通過阻斷STAT3的組成型激活從而抑