姜黃素對酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、酒精濫用和酒精依賴已成為當(dāng)今世界上日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，特別是青少年飲酒更值得人們重視。肝臟是酒精吸收后的主要代謝場所，也是毒害的主要靶器官。乙醇對肝細(xì)胞的損傷，涉及多種機(jī)制，但氧化損傷是其共同的早期改變，主要表現(xiàn)為：活性氧(ROS)大量產(chǎn)生，氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，脂質(zhì)代謝紊亂，生物大分子氧化變性與加合物形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的紊亂。 姜黃素是一種天然的抗氧化物質(zhì)，屬于多酚類化合物，幾乎無毒，其不僅在食品體系顯出很強(qiáng)的抗

2、氧化活性，而且在生物體內(nèi)也顯出較強(qiáng)的抗氧化性。最近，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)它能抑制許多與過氧化相關(guān)的疾病，于是它在生物體內(nèi)的抗氧化性引起人們的注目。其廣泛的生物活性包括抗炎、抗氧化、抗誘變，降血脂及抗動脈粥樣硬化，抗腫瘤(拮抗致癌過程中所造成的DNA損傷作用)等等。姜黃素不僅本身具有抗氧化活性，還能清除自由基，提高自由基清除劑含量和誘導(dǎo)抗氧化酶活性。 HO-1基因的誘導(dǎo)主要在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)節(jié)。已經(jīng)確定的是，在HO-1基因啟動子上游發(fā)現(xiàn)有多個抗

3、氧化劑反應(yīng)元件(antioxidant-responseelement，ARE)，目前發(fā)現(xiàn)的ARE結(jié)合蛋白有Nrf2和MafK，前者在氧化劑刺激下激活，而后者正相反。Nrf2的活性通常在胞質(zhì)中通過一種與伴侶蛋白Keap1結(jié)合而被抑制。但是，當(dāng)擁有修飾巰醇基能力的親電子基團(tuán)或者化合物的不斷積聚，Keap1對Nrf2活性的抑制就消失了，Nrf2易位進(jìn)入核內(nèi)，作用于ARE。 姜黃素還是血紅素氧化酶-1(HO-1)的天然誘導(dǎo)劑。在機(jī)體內(nèi)

4、源性抗氧化系統(tǒng)中，Ⅰ型血紅素氧化酶(HemeOxygenase-1，HO-1)因其應(yīng)激性、可誘導(dǎo)性和對多種氧化損傷(如缺血、缺氧、高溫、輻射及外源性化合物等引起)良好的保護(hù)效應(yīng)，近年來備受關(guān)注，成為預(yù)防氧化攻擊的首選靶基因之一。HO-1系統(tǒng)被認(rèn)為具有抗氧化、維持微循環(huán)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及抗炎等功能。Motterlini等人最近證實在內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中HO-1可以被caffeicacidphenethylester(CAPE)和姜黃素誘導(dǎo)，

5、因此，我們可以假設(shè)這些天然物質(zhì)具有抗氧化的功效可能與它們可以激活HO-1途徑有關(guān)。最近的研究也證實在極度的低氧環(huán)境中，正是由于姜黃素可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞HO-1表達(dá)，因此幫助細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激。 基于以上分析，我們假設(shè)姜黃素通過Nrf2/ARE信號通路誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，進(jìn)而表現(xiàn)出對酒精性肝損傷的保護(hù)效應(yīng)。 研究目的： 本項目擬以大鼠原代肝細(xì)胞為研究對象，以HO-1為靶點(diǎn)，觀察姜黃素對細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用，研究姜黃素誘導(dǎo)

6、HO-1與Nrf2活化的分子機(jī)制。 研究方法： 本實驗以原代大鼠肝細(xì)胞為研究對象，用含不同濃度酒精的培養(yǎng)基培養(yǎng)，于不同時間收集細(xì)胞，用酶學(xué)方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH，GOT水平。用酶學(xué)、生化學(xué)等方法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA，GSH及SOD活性。觀察酒精對肝細(xì)胞氧化損傷的時間劑量效應(yīng)，建立大鼠肝細(xì)胞氧化損傷模型。觀察姜黃素對酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。根據(jù)前面實驗的氧化損傷模型參數(shù)，在使用酒精染毒細(xì)胞前，用姜黃素預(yù)處理

7、肝細(xì)胞，觀察姜黃素對肝細(xì)胞保護(hù)的時間-劑量效應(yīng)情況，測定指標(biāo)同前，從而確定姜黃素對肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。為了證實HO-1/Nrf2途徑在姜黃素抗氧化能力中的作用，使用HO-1經(jīng)典誘導(dǎo)劑Hemin及抑制劑ZnPPⅨ作用肝細(xì)胞，梯度離心提取肝細(xì)胞微粒體，對比姜黃素組觀察各組誘導(dǎo)HO-1活性的能力。在此基礎(chǔ)上，使用westernblot方法檢測姜黃素干預(yù)對肝細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)影響，以及與MAPK各級聯(lián)通路抑制劑共孵育后Nrf2蛋白表達(dá)水

8、平的變化，研究姜黃素誘導(dǎo)HO-1與Nrf2活化的分子機(jī)制。 研究結(jié)果： 1、酒精對肝細(xì)胞的損傷程度與給予酒精的濃度以及作用時間呈正相關(guān)。隨著酒精濃度的增加，肝細(xì)胞的活力逐漸降低，脂質(zhì)過氧化程度不斷加重，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶水平不斷下降，在100mmol/L時，影響程度明顯。隨著酒精作用時間的延長，相對于正常對照組，細(xì)胞活力降低、脂質(zhì)過氧化程度加重，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶水平降低，在8h時影響程度明顯。 2、姜黃素能降低酒精誘導(dǎo)

9、的肝細(xì)胞氧化損傷。在乙醇作用前，預(yù)先給予姜黃素進(jìn)行干預(yù)，可明顯減輕酒精所致的GSH消耗、抗氧化酶失活和脂質(zhì)過氧化，提高細(xì)胞的代謝活力，促使失衡的抗氧化系統(tǒng)盡快恢復(fù)，對細(xì)胞酒精性氧化損傷表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)效應(yīng)。 3、姜黃素能夠誘導(dǎo)HO-1發(fā)揮抗氧化作用。HO-1活性和表達(dá)與肝細(xì)胞的氧化抗氧化水平相關(guān)，抗氧化水平較好的15μmol/L預(yù)作用1h時，HO-1活性最高。姜黃素能誘導(dǎo)HO-1的活性和表達(dá)，在15μmol/L和6h時達(dá)到高峰。

10、 4、ERK信號通路抑制劑PD980059、P38信號通例抑制劑SB203580以及JNK信號抑制劑SP600125不能抑制姜黃素誘導(dǎo)Nrf2蛋白的表達(dá)；而加入PI3K信號通路抑制劑wortmannin和LY294002后，能阻止姜黃素誘導(dǎo)Nrf2蛋白表達(dá)。 結(jié)論： 姜黃素對肝細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，能部分對抗酒精對肝細(xì)胞的氧化損害，其主要表現(xiàn)在：提高細(xì)胞的活性；減少細(xì)胞損傷；提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶水平，降低脂質(zhì)過氧化