重組SSAO在293T細胞中的定位及酶活性測定.pdf

1、目的：
　　氨基脲敏感型胺氧化酶（semicarbazide-sensitive amine oxidase, SSAO, EC1.4.3.6）是一類含銅和醌并對氨基脲敏感的胺氧化酶，其廣泛分布于各種組織及血液中，SSAO具有氧化脫氨基作用，能夠催化脂肪族和芳香族伯胺類化合物轉化為相應的醛、過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）和氨（Ammonia，NH3）。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SSAO可參與葡萄糖轉運，抑制脂肪分解

2、，參與氧化應激與粒細胞滲透，其催化產生的代謝醛類產物可引起蛋白交聯(lián)，造成血管內皮細胞損傷，可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關。一些疾病如阿爾茨海默癥、急性或慢性炎癥及Ⅰ型Ⅱ型糖尿病患者的組織或血漿中SSAO活性均發(fā)生變化，這使SSAO成為相關疾病的潛在治療靶點，但目前對SSAO的病理生理功能還未完全闡明。由于體外分離培養(yǎng)的細胞處于去分化狀態(tài)，不表達或低表達SSAO，因此，為了在體外大量表達SSAO，本文在pcDNA3-SSAO和pcFLA

3、G-SSAO表達載體基礎上構建了pEGFP-N3-SSAO和pIRES2-EGFP-SSAO兩種重組表達質粒，將以上四種重組質粒在293T細胞中進行瞬時轉染，分析轉染后外源重組表達的SSAO在細胞內的定位情況及其酶活性，從而篩選出體外表達活性較高的重組質粒，為后續(xù)對SSAO病理生理功能的研究提供基礎。
　　方法：
　　⑴以pcDNA3-SSAO為模板設計獲取SSAO編碼區(qū)全序列的引物，利用PCR擴增技術獲取SSAO編碼區(qū)全序

4、列，將上述PCR產物用BamH I和Sal I雙酶切，載體質粒pIRES2-EGFP、pEGFP-N3分別用Bgl II和Sal I雙酶切，利用T4連接酶將PCR產物分別連入相應表達載體中，構建SSAO與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達質粒pEGFP-N3-SSAO和共表達質粒pIRES2-EGFP-SSAO。⑵將所得重組質粒及原有質粒pcFLAG-SSAO瞬時轉染293T細胞，細胞培養(yǎng)36 h后，將轉染pcFLAG-SSAO的細胞經免

5、疫熒光染色后，并分別將各組轉染細胞進行DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光和紅色熒光的分布及表達情況。⑶將重組質粒pcDNA3-SSAO、pcFLAG-SSAO、pEGFP-N3-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO和相應空質粒載體瞬時轉染293T細胞，培養(yǎng)36 h后，收集上述細胞和未轉染的293T細胞，經超聲破碎后，取細胞勻漿通過高效液相色譜法（HPLC），檢測瞬時轉染細胞中SSAO活性。
　　結果：
　?、贉y序

6、結果證明兩種重組真核表達質粒pEGFP-N3-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO構建正確。②在轉染后的293T細胞中，轉染pEGFP-N3及pIRES2-EGFP空載體的細胞內，綠色熒光均勻分布于細胞質中；轉染pIRES2-EGFP-SSAO質粒的細胞內，綠色熒光同樣分布于細胞質中；轉染pEGFP-N3-SSAO質粒的細胞內，綠色熒光分布于細胞膜中，轉染pcFLAG-SSAO質粒的細胞內，紅色熒光分布于細胞膜。③SSAO活性檢測

7、結果顯示為：四種空載質粒轉染的293T細胞的SSAO活性極低，轉染 pcFLAG-SSAO質粒的293T細胞 SSAO活性為111.5±7.1 nmoL/mg/h，轉染pIRES2-EGFP-SSAO質粒的293T細胞 SSAO活性為117.2±9.5 nmoL/mg/h，轉染pcDNA3-SSAO質粒的293T細胞 SSAO活性為215.7±21.4 nmoL/mg/h，轉染pEGFP-N3-SSAO質粒的293T細胞檢測到極低的SS