重組SSAO在293T細(xì)胞中的定位及酶活性測(cè)定.pdf

1、目的：
　　氨基脲敏感型胺氧化酶（semicarbazide-sensitive amine oxidase, SSAO, EC1.4.3.6）是一類含銅和醌并對(duì)氨基脲敏感的胺氧化酶，其廣泛分布于各種組織及血液中，SSAO具有氧化脫氨基作用，能夠催化脂肪族和芳香族伯胺類化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛、過(guò)氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）和氨（Ammonia，NH3）。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SSAO可參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制脂肪分解

2、，參與氧化應(yīng)激與粒細(xì)胞滲透，其催化產(chǎn)生的代謝醛類產(chǎn)物可引起蛋白交聯(lián)，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。一些疾病如阿爾茨海默癥、急性或慢性炎癥及Ⅰ型Ⅱ型糖尿病患者的組織或血漿中SSAO活性均發(fā)生變化，這使SSAO成為相關(guān)疾病的潛在治療靶點(diǎn)，但目前對(duì)SSAO的病理生理功能還未完全闡明。由于體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞處于去分化狀態(tài)，不表達(dá)或低表達(dá)SSAO，因此，為了在體外大量表達(dá)SSAO，本文在pcDNA3-SSAO和pcFLA

3、G-SSAO表達(dá)載體基礎(chǔ)上構(gòu)建了pEGFP-N3-SSAO和pIRES2-EGFP-SSAO兩種重組表達(dá)質(zhì)粒，將以上四種重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分析轉(zhuǎn)染后外源重組表達(dá)的SSAO在細(xì)胞內(nèi)的定位情況及其酶活性，從而篩選出體外表達(dá)活性較高的重組質(zhì)粒，為后續(xù)對(duì)SSAO病理生理功能的研究提供基礎(chǔ)。
　　方法：
　?、乓詐cDNA3-SSAO為模板設(shè)計(jì)獲取SSAO編碼區(qū)全序列的引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲取SSAO編碼區(qū)全序

4、列，將上述PCR產(chǎn)物用BamH I和Sal I雙酶切，載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP、pEGFP-N3分別用Bgl II和Sal I雙酶切，利用T4連接酶將PCR產(chǎn)物分別連入相應(yīng)表達(dá)載體中，構(gòu)建SSAO與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-SSAO和共表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-SSAO。⑵將所得重組質(zhì)粒及原有質(zhì)粒pcFLAG-SSAO瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，將轉(zhuǎn)染pcFLAG-SSAO的細(xì)胞經(jīng)免

5、疫熒光染色后，并分別將各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光和紅色熒光的分布及表達(dá)情況。⑶將重組質(zhì)粒pcDNA3-SSAO、pcFLAG-SSAO、pEGFP-N3-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO和相應(yīng)空質(zhì)粒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)36 h后，收集上述細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，經(jīng)超聲破碎后，取細(xì)胞勻漿通過(guò)高效液相色譜法（HPLC），檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SSAO活性。
　　結(jié)果：
　?、贉y(cè)序

6、結(jié)果證明兩種重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO構(gòu)建正確。②在轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3及pIRES2-EGFP空載體的細(xì)胞內(nèi)，綠色熒光均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中；轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-SSAO質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)，綠色熒光同樣分布于細(xì)胞質(zhì)中；轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-SSAO質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)，綠色熒光分布于細(xì)胞膜中，轉(zhuǎn)染pcFLAG-SSAO質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)，紅色熒光分布于細(xì)胞膜。③SSAO活性檢測(cè)

7、結(jié)果顯示為：四種空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的SSAO活性極低，轉(zhuǎn)染 pcFLAG-SSAO質(zhì)粒的293T細(xì)胞 SSAO活性為111.5±7.1 nmoL/mg/h，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-SSAO質(zhì)粒的293T細(xì)胞 SSAO活性為117.2±9.5 nmoL/mg/h，轉(zhuǎn)染pcDNA3-SSAO質(zhì)粒的293T細(xì)胞 SSAO活性為215.7±21.4 nmoL/mg/h，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-SSAO質(zhì)粒的293T細(xì)胞檢測(cè)到極低的SS