APP亞片段真核細(xì)胞載體的構(gòu)建及其在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、研究目的:目前AD的疫苗研制大多都是以Aβ為靶點(diǎn)進(jìn)行的。但通過內(nèi)吞作用沉積于細(xì)胞內(nèi)的Aβ同樣會影響AD的發(fā)生發(fā)展。可大多數(shù)抗體不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),故對此顯得束手無策。因此從源頭減少Aβ的產(chǎn)生就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)探索APPβ剪切位點(diǎn)上游區(qū)域,欲從中尋找出對Aβ生成起到調(diào)控作用的結(jié)構(gòu),從而為尋找新的治療靶位及下一步新型疫苗的研發(fā)打下基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:構(gòu)建加載有APPsw695亞片段基因與GFP融合基因的pcdna3.1+真核細(xì)胞

2、載體,其中亞片段基因包括APPl-695、APP265-695、APP507-695及APP590-695等多核苷酸鏈。構(gòu)建后經(jīng)通過測序,符合預(yù)期要求。將重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中,作為實(shí)驗(yàn)組。以未轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞作為對照組。轉(zhuǎn)染36小時(shí)后通過WB(Westernblot)方法對Aβ產(chǎn)量進(jìn)行半定量分析及MTT法的對細(xì)胞活性進(jìn)行檢測。所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行x2檢驗(yàn),檢驗(yàn)

3、水準(zhǔn)Q=0.05,P＜0.05表示有顯著性差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)后的片段于大腸桿菌中擴(kuò)增量較高且對宿主增殖無明顯影響,經(jīng)測序證實(shí)符合預(yù)期要求。
　　 2.轉(zhuǎn)染后分別于24h、36h、48h于倒置顯微鏡下對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀測,發(fā)現(xiàn)貼壁率逐漸下降,且各培養(yǎng)基顏色未見變化提示無消耗產(chǎn)酸跡象。至60h左右,各組細(xì)胞完全脫壁,聚集成團(tuán)懸浮于培養(yǎng)液中。
　　 3.對各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染36h后上清液中A

4、B進(jìn)行檢測,于4.5KD位置無明顯條帶顯影。
　　 結(jié)論:
　　 1.將突變基因點(diǎn)對應(yīng)基因(APPsw695:K595N、M596L)優(yōu)化為符合細(xì)菌宿主的AATCTG與AACCTG,有助于細(xì)菌的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒的擴(kuò)增。
　　 2.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在對HEK-293T細(xì)胞進(jìn)行APPSWI-695轉(zhuǎn)染過程中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率逐漸下降直至死亡,提示此種細(xì)胞可能不適用于AD模型的制造。接觸性抑制弱的細(xì)胞可能成為AD模型的首

5、選。
　　 3.雖然Aβ作為“瀑布級聯(lián)學(xué)說”的起始致病因素,但APP所造成細(xì)胞間的相互交聯(lián),可能也對細(xì)胞的活性也產(chǎn)生負(fù)性影響,其在發(fā)病過程中的作用較以往認(rèn)識更為重要。
　　 4.WB技術(shù)在對小分子蛋白的檢測中仍表現(xiàn)欠佳,因此目前研究Aβ應(yīng)避免采取此種方法進(jìn)行檢測。
　　 5.在體外Aβ可能進(jìn)一步聚合成多聚體形式,從而造成WB的特異性一抗,對于此產(chǎn)物并不能識別,因此造成此次試驗(yàn)的假陰性結(jié)果。進(jìn)一步探索Aβ體外多聚體