新基因ARG1對(duì)染砷后293T細(xì)胞增殖凋亡以及MAPK信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的觀察ARG1基因?qū)?93T細(xì)胞的增殖、凋亡以及p-JNK、p-ERK表達(dá)量的影響，并探討ARG1的抗砷作用。
　　 方法（1）重組質(zhì)粒pcDNA-ARG1及空質(zhì)粒抽提后采用PCR的方法進(jìn)行質(zhì)粒鑒定，最后進(jìn)行質(zhì)粒DNA測(cè)序；（2）將ARG1表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IE-ARG1及空載體對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1-IE分別經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體（Lipofectamine2000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞后，采用熒光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)

2、染效果；（3）提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后使用Real-Time PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞的ARG1表達(dá)量；
　　 （4）將實(shí)驗(yàn)組pcDNA3.1-IE-ARG1-293T細(xì)胞、空白對(duì)照組pcDNA3.1-IE-293T細(xì)胞及陰性對(duì)照組293T細(xì)胞分別與0、1、2、4、8、16、32 μmol/L濃度的NaAsO2孵育48 h后，使用MTT法檢測(cè)ARG1基因?qū)ι槿径竞?93T細(xì)胞增殖的影響；（5）根據(jù)MTT結(jié)果將

3、實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組細(xì)胞分別與0、1、4、8 μmol/L濃度NaAsO2孵育48 h后，加入Annexin V FITC/PI凋亡試劑，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況；同時(shí)提取細(xì)胞的蛋白后，采用Western Blot法檢測(cè)p-JNK、p-ERK蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果（1）PCR顯示我們所克隆的的基因長(zhǎng)度正確，測(cè)序結(jié)果得出基因的序列也完全正確；（2）熒光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染有目的基因的239T細(xì)胞膜表達(dá)強(qiáng)綠色

4、熒光，轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光呈彌散狀態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示轉(zhuǎn)染率可達(dá)75-85％；（3）Real Time PCR結(jié)果表明293T細(xì)胞ARG1表達(dá)量很低，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞ARG1的表達(dá)量是空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組的10倍左右（p<0.05）；（4）NaAsO2在1-8 μmol/L時(shí)，ARG1基因過(guò)表達(dá)的239T細(xì)胞增殖抑制率明顯低于對(duì)照組（p<0.05），而在濃度>8 μmol/L時(shí)則沒(méi)有明顯差異（p>0.05）；（5）NaAsO2濃度≤

5、8 μmol/L時(shí)，ARG1基因過(guò)表達(dá)的239T細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組（p<0.05）；（6）p-JNK表達(dá)量在轉(zhuǎn)染前后均隨著NaAsO2濃度的增加而增加，但是ARG1基因過(guò)表達(dá)的239T細(xì)胞的p-JNK的表達(dá)量在各濃度均明顯低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（p<0.05）；當(dāng)NaAsO2的濃度在0-4 μmol/L時(shí)，ARG1基因過(guò)表達(dá)的239T細(xì)胞p-ERK的相對(duì)表達(dá)量隨著砷濃度的增加而增加，在8 μmol/L時(shí)表達(dá)量有所下降，但是仍然