MBD2基因敲除緩解高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人民生活水平的提高，肥胖癥開(kāi)始遍及全球。中國(guó)肥胖人群數(shù)量?jī)H次于美國(guó)，位居第二位。作為曾經(jīng)的“瘦人大國(guó)”，中國(guó)在很短的時(shí)間內(nèi)，變成了“肥胖大國(guó)”。肥胖與糖尿病、高血壓、冠心病等慢性非傳染性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是其重要的危險(xiǎn)因素之一。
　　肥胖癥是一個(gè)多因素的疾病，與遺傳、飲食、生活習(xí)慣、環(huán)境等因素息息相關(guān)。近年來(lái)關(guān)于肥胖及2型糖尿病的遺傳學(xué)研究取得了較大的進(jìn)展，大量的GWAS研究篩選出約40個(gè)與

2、遺傳易感性相關(guān)的靶基因，然而這些易感基因只能解釋20％病人的發(fā)病。而作為肥胖病發(fā)生的一個(gè)重要的因素，即環(huán)境因素如何對(duì)肥胖起作用，目前越來(lái)越受到重視。最新研究表明，表觀遺傳在基因表達(dá)調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化以及疾病中起著中心的作用。表觀遺傳學(xué)包括DNA甲基化、組蛋白修飾和小分子RNA（MicroRNA和SiRNA等）。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄但不改變其核苷酸序列，被認(rèn)為是連接環(huán)境因素與遺傳物質(zhì)之間的重要橋梁。飲食、生活方式

3、、社會(huì)或家庭壓力、慢性炎癥、細(xì)菌感染、射線及毒物等諸多環(huán)境因素均可誘導(dǎo)DNA甲基化水平或模式的改變，故DNA甲基化可記錄不同個(gè)體一生中對(duì)各種環(huán)境誘因的暴露，編碼基因組以外的信息，參與調(diào)控個(gè)體對(duì)疾病的易感性如對(duì)肥胖病的易感性。
　　DNA甲基化的表觀遺傳信息是由甲基化CpG結(jié)合蛋白解讀的。甲基化CpG結(jié)合蛋白家族包括MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和 MBD4，它們以細(xì)胞和基因特異性方式結(jié)合到甲基化的CpG DNA上，其中M

4、BD2與甲基化CpG DNA的親和力最高。一旦它們與靶基因調(diào)控區(qū)域甲基化CpG DNA結(jié)合，即招摹染色質(zhì)重塑或是修飾因子，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，干擾轉(zhuǎn)錄因子與靶標(biāo)基因的結(jié)合，進(jìn)而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。因此，MBD2蛋白是研究表觀遺傳學(xué)良好的靶點(diǎn)。
　　胎兒期宮內(nèi)環(huán)境通過(guò)改變DNA甲基化參與到成年后肥胖的發(fā)病過(guò)程已被研究者們所公認(rèn)。高脂飲食通過(guò)改變DNA甲基化，實(shí)現(xiàn)代間傳遞，影響到后代的脂肪、肝臟的功能從而促進(jìn)糖代謝異常以及2型糖尿病的發(fā)生。

5、食物中，甲基供體直接影響肝臟 DNA甲基化水平，參與到非酒精性脂肪肝的發(fā)生。這些都為我們研究DNA甲基化與肥胖提供了重要線索。
　　GWAS研究揭示MBD2與2型糖尿病的易感性相關(guān)，且介導(dǎo)的遺傳易感性為普通人群的1.45倍；后續(xù)GWAS研究進(jìn)一步揭示 MBD2是肥胖癥的易感基因，故在GWAS的數(shù)據(jù)庫(kù)中，MBD2被列入與肥胖關(guān)聯(lián)的易感基因。我們實(shí)驗(yàn)室在繁殖飼養(yǎng)Mbd2敲除小鼠過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)Mbd2敲除小鼠體重偏輕。結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道，

6、我們?cè)O(shè)想：DNA甲基化參與到肥胖的發(fā)生，高脂飲食誘導(dǎo)小鼠脂肪組織基因組DNA發(fā)生甲基化改變，該甲基化的信息由MBD2蛋白解讀，Mbd2基因敲除后甲基化變化的信息不被解讀，從而保護(hù)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。因此，我們給予Mbd2野生型以及敲除型小鼠高脂飲食喂養(yǎng)，誘導(dǎo)肥胖模型，觀察Mbd2在高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖中的作用。同時(shí)我們采用MBD2 Chip-seq的技術(shù)，進(jìn)行高通量測(cè)序，觀察高脂飲食誘導(dǎo)DNA甲基化的模式改變，并篩選Mbd2調(diào)控的靶基因

7、。通過(guò)本項(xiàng)目研究不僅從新的視角闡述肥胖癥發(fā)生的病理機(jī)制，而且為臨床預(yù)防、治療肥胖癥提供新的思路以及線索，對(duì)于探索新的代謝性疾病的防治策略具有重要意義。
　　方法與結(jié)果：我們用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖模型，誘導(dǎo)16周，研究MBD2在肥胖病發(fā)病中的作用，觀察MBD2在高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的糖代謝、脂代謝以及能量代謝中的作用。同時(shí)，將Mbd2敲除小鼠和ob/ob小鼠雜交，得到Mbd2（-/-）ob/ob雙敲除小鼠，觀察Mbd2在肥胖模式動(dòng)物中的

8、作用。結(jié)果示：高脂飲食連續(xù)喂養(yǎng)4周時(shí)，給予高脂飲食喂養(yǎng)野生型小鼠體重高于普通飲食喂養(yǎng)小鼠的體重，提示高脂飲食誘導(dǎo)成功，當(dāng)喂養(yǎng)到8周時(shí)，Mbd2野生型小鼠體重即比敲除小鼠體重高。繼續(xù)喂養(yǎng)，當(dāng)喂養(yǎng)總時(shí)間為16周時(shí)，體重差異明顯。高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠Mbd2敲除小鼠附睪脂肪組織重量明顯小于野生型小鼠脂肪組織重量。為了排除Mbd2基因敲除影響小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的原因，處死小鼠時(shí)，我們測(cè)量了小鼠脛骨的長(zhǎng)度，Mbd2敲除小鼠和野生型小鼠脛骨長(zhǎng)度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、差別，提示Mbd2敲除沒(méi)有對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。在小鼠開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)月（第8-12周），連續(xù)記錄小鼠的攝食。結(jié)果顯示，Mbd2敲除小鼠攝食量大于野生型小鼠。高脂飲食誘導(dǎo)16周時(shí)，空腹?fàn)顟B(tài)下普通飲食小鼠，WT組小鼠與KO組小鼠血糖值兩組之間有一定的差別，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)16周時(shí)，野生型小鼠空腹血糖與Mbd2敲除小鼠血糖值相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們也檢測(cè)了進(jìn)食狀態(tài)下的血糖值，得到了一致的結(jié)果。同時(shí)，我們也用ELISA的方

10、法檢測(cè)了空腹?fàn)顟B(tài)下的胰島素的水平。高脂飲食喂養(yǎng)情況下，野生型小鼠空腹胰島素濃度是敲除小鼠胰島素濃度的1.95倍。為了更進(jìn)一步反應(yīng)機(jī)體的糖代謝異常，我們采用了通用的胰島素穩(wěn)態(tài)模型（HOMA-IR）來(lái)反應(yīng)胰島素抵抗的情況。普通飲食情況下，野生型小鼠和Mbd2敲除小鼠HOMA-IR值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；高脂飲食情況下，野生型HOMA-IR值為敲除組的2.67倍。接著我們給小鼠予以葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)以及胰島素敏感實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩項(xiàng)指標(biāo)均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差

11、異。此外，我們用Western Blot檢測(cè)附睪脂肪中胰島素相關(guān)的信號(hào)通路蛋白。檢測(cè)p-IRS Y989/IRS以及P-AktThr308/Akt的表達(dá)水平，結(jié)果顯示高脂飲食誘導(dǎo)情況下，脂肪組織中p-IRS以及p-Akt的表達(dá)量均明顯下降，Mbd2敲除小鼠p-IRS以及p-Akt表達(dá)量高于野生型小鼠。此結(jié)果從分子水平反應(yīng)Mbd2敲除小鼠脂肪組織胰島素抵抗輕于野生型小鼠。同時(shí)，我們將Mbd2小鼠和ob/ob小鼠雜交，得到Mbd2（-/-）

12、ob/ob雙敲除的小鼠，初步觀察到雙敲除的小鼠體重低于ob/ob小鼠，脂肪細(xì)胞面積小于ob/ob小鼠，以及肝臟脂肪沉積少于ob/ob小鼠。綜合以上結(jié)果說(shuō)明，Mbd2敲除能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的葡萄糖耐量異常以及胰島素抵抗。
　　為了研究DNA甲基化在肥胖發(fā)生中的作用機(jī)制，我們首先從整體水平觀察DNA甲基化在肥胖發(fā)生中的變化。我們?nèi)「讲G脂肪組織，提取基因組DNA，用ELISA的方法檢測(cè)基因組 DNA總甲基化的情況，高脂飲食誘導(dǎo)

13、肥胖時(shí)DNA甲基化的比率下降了約40%。而在普通飲食情況下，Mbd2野生型以及敲除型小鼠附睪脂肪組織DNA甲基化沒(méi)有明顯變化。此結(jié)果說(shuō)明，給予高脂飲食誘導(dǎo)肥胖時(shí)，附睪脂肪組織基因組DNA發(fā)生低甲基化，而且在普通飲食情況下Mbd2敲除小鼠以及野生型小鼠附睪脂肪組織甲基化沒(méi)有明顯區(qū)別。同時(shí)為了解在肥胖病人是否也出現(xiàn)這一現(xiàn)象。我們收集了肥胖病人以及正常人大網(wǎng)膜組織樣本，檢測(cè)其DNA甲基化比率，發(fā)現(xiàn)肥胖患者DNA甲基化低于正常人基因組DNA甲基

14、化情況，該結(jié)果和小鼠中的結(jié)果一致，更進(jìn)一步驗(yàn)證了該現(xiàn)象。接著我們檢測(cè) MBD2蛋白在肥胖相關(guān)的靶器官中的表達(dá)情況，在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中，附睪脂肪、肝臟、骨骼肌中MBD2蛋白表達(dá)都降低，該趨勢(shì)同DNA甲基化程度趨勢(shì)一致。為了尋找MBD2結(jié)合的靶標(biāo)基因，以及分析全基因組DNA甲基化變化的模式，我們采用了MBD2 Chip-seq的方法。我們先進(jìn)行MBD2染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，得到與MBD2結(jié)合的DNA，然后將DNA樣品交由華大基因公司

15、進(jìn)行高通量測(cè)序。檢測(cè)及分析結(jié)果提示，經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)后，出現(xiàn)了甲基化的變化，其中以高脂飲食中特異性的基因增多為特點(diǎn)。同時(shí)也對(duì)相同的peaks區(qū)域的富集度做了分析。結(jié)果顯示高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠和普通飲食小鼠附睪脂肪組織DNA甲基化模式存在差異。結(jié)合前面的表型以及初步結(jié)果，我們提出假設(shè)：生理情況下，機(jī)體中能量?jī)?chǔ)存與能量消耗相平衡，當(dāng)高脂飲食刺激時(shí)，機(jī)體全基因組發(fā)生DNA低甲基化改變，其中DNA低甲基化改變對(duì)能量?jī)?chǔ)存的基因影響大，促使機(jī)體儲(chǔ)存更

16、多的能量，進(jìn)而造成肥胖的發(fā)生。當(dāng)MBD2缺失時(shí)，該甲基化變化信息不被解讀，進(jìn)而保護(hù)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖的發(fā)生。為了證明我們的假設(shè)，我們從中挑選了一些抑制肥胖發(fā)生以及促進(jìn)肥胖發(fā)生的基因進(jìn)行甲基化分析。抑制肥胖發(fā)生的基因Ucp1，Leptin轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游peaks區(qū)域發(fā)生DNA低甲基化改變。促進(jìn)肥胖發(fā)生的基因，Hif1-α以及Raptor也發(fā)生DNA低甲基化改變。同時(shí)，我們對(duì)這些區(qū)域做了生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些區(qū)域均有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因

17、子結(jié)合位點(diǎn)。我們對(duì)這些基因做了mRNA水平以及蛋白水平的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA出現(xiàn)低甲基化改變時(shí)，相應(yīng)的mRNA水平和（或）蛋白水平升高。
　　結(jié)論：本研究初步揭示了DNA甲基化與肥胖的關(guān)系。我們首先發(fā)現(xiàn)Mbd2敲除顯著緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖的發(fā)生，以及能夠顯著緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠糖代謝異常，脂代謝異常以及脂肪肝的發(fā)生，Mbd2敲除可能通過(guò)增加能量代謝減緩肥胖的發(fā)生。Mbd2敲除可以緩解ob/ob小鼠的肥胖的發(fā)生以及脂肪肝的