雄黃干擾小鼠海馬組織谷胱甘肽合成誘發(fā)神經(jīng)毒性及甘草次酸保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　雄黃(realgar)是一種含砷礦物藥，作為藥用在中國(guó)已有上千年的歷史。臨床上由于未科學(xué)/合理使用單味雄黃或其復(fù)方制劑引起不良反應(yīng)或慢性砷中毒事件時(shí)有報(bào)道，由此引發(fā)的雄黃對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響，已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)雄黃中的砷能通過(guò)血腦屏障在腦組織中積聚。流行病學(xué)調(diào)查顯示長(zhǎng)期接觸砷可導(dǎo)致認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)神經(jīng)功能障礙;動(dòng)物體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)砷可干擾突觸傳遞，影響長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，引起學(xué)習(xí)記憶缺陷。因此超量或低量長(zhǎng)期服用

2、雄黃或其制劑具有潛在的神經(jīng)毒性。
　　有研究表明砷通過(guò)影響體內(nèi)氧化還原平衡，降低谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平和抗氧化酶活性，使腦組織受到自由基損害，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞異常凋亡。GSH是腦內(nèi)主要的抗氧化劑，在砷等毒物解毒和防御氧化應(yīng)激方面具有重要作用。決定腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞GSH合成的主要因素涉及:(1)前體物質(zhì)谷氨酸(glutamate，Glu)和半胱氨酸(cysteine，Cys);(2)前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)體XAG-系統(tǒng)和XC

3、-系統(tǒng);(3)GSH合成限速酶γ-GCS及對(duì)其調(diào)控的Nrf2;(4)為神經(jīng)元合成GSH提供前體物質(zhì)的MRP-1和γ-GT。那么，雄黃中的砷是否影響決定神經(jīng)細(xì)胞GSH合成的這些因素，干擾GSH合成，以及其可能分子機(jī)制尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)是甘草酸及其鹽（即甘草甜素）的代謝產(chǎn)物，是甘草發(fā)揮藥效的主要有效成分。研究表明，甘草次酸具有抗腫瘤、抗炎抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等諸多藥理活性。

4、在中醫(yī)藥學(xué)的研究中，已有報(bào)道甘草對(duì)雄黃有配伍解毒的效應(yīng)。此外，有研究顯示甘草次酸能通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，緩解腦缺血再灌注引起的GSH以及自由基清除酶的降低。那么，甘草次酸對(duì)雄黃引起的神經(jīng)毒性是否有拮抗作用，其機(jī)制如何，目前未見報(bào)道。
　　本研究通過(guò)ICR小鼠灌服不同劑量雄黃，建立亞慢性雄黃染毒動(dòng)物模型，運(yùn)用行為學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等多種檢測(cè)手段，觀察雄黃對(duì)海馬組織XAG-系統(tǒng)、XC-系統(tǒng)、γ-GCS、MRP-1、γ-GT、G

5、lu、Cys及Nrf2的影響，旨在闡明雄黃干擾GSH合成的分子靶點(diǎn)與相關(guān)機(jī)制。同時(shí)給予甘草次酸干預(yù)，探討甘草次酸對(duì)雄黃神經(jīng)毒性的拮抗作用，為甘草次酸對(duì)雄黃引起的慢性砷中毒的防治，以及在中醫(yī)藥臨床應(yīng)用中雄黃與甘草配伍機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)雄性ICR小鼠266只，體重18～22 g。按體重隨機(jī)分為7組，每組38只。第1組為對(duì)照組，灌胃給予0.5％(w/v)羧甲基纖維

6、素鈉(sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na)水溶液;第2～4組為低、中、高劑量雄黃暴露組，分別連續(xù)灌胃給予雄黃混懸液0.15g/kg、0.45g/kg、1.35g/kg，以0.5％CMC-Na水溶液為混懸介質(zhì)，第5組為甘草次酸對(duì)照組，灌胃給予甘草次酸48mg/kg，以0.5％CMC-Na水溶液為混懸介質(zhì);第6組為低劑量甘草次酸干預(yù)組，灌胃給予甘草次酸16 mg/kg+雄黃1.35g/kg混懸液;第7組

7、為高劑量甘草次酸干預(yù)組，灌胃給予甘草次酸48mg/kg+雄黃1.35g/kg混懸液。每日1次，連續(xù)灌胃8周。染毒結(jié)束后進(jìn)行各種指標(biāo)測(cè)定:采用氫化物發(fā)生-火焰原子吸收法(HG-FAAS)測(cè)定全血和腦組織中砷含量;采用新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)測(cè)試小鼠的認(rèn)知功能和記憶能力;應(yīng)用透射電子顯微鏡技術(shù)觀察小鼠海馬神經(jīng)元和突觸的超微結(jié)構(gòu);采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定海馬組織中GSH和腦組織中活性硫含量;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定小鼠海馬組織EAAT1、

8、EAAT2、EAAT3、xCT、Nrf2、HO-1、MRP-1、GCLC和GCLM的mRNA表達(dá)水平;采用Western blot法測(cè)定海馬組織EAAT1、EAAT2、EAAT3、xCT、Nrf2、HO-1、MRP-1、GCLC和GCLM的蛋白表達(dá)水平;采用免疫熒光化學(xué)染色法測(cè)定海馬組織中EAAT3、xCT、MRP-1和Nrf2蛋白的細(xì)胞定位;采用微透析法-HPLC聯(lián)用技術(shù)測(cè)定海馬CA1區(qū)細(xì)胞外液中Glu和Cys的含量;采用酶聯(lián)免疫吸附

9、試驗(yàn)測(cè)定海馬組織中γ-GT的含量。
　　結(jié)果：
　　一、雄黃中砷致小鼠認(rèn)知功能損傷的毒性作用
　　新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠對(duì)新物體的探索時(shí)間百分比為54.19％，略高于機(jī)會(huì)水平(50％)，表明對(duì)照組小鼠用于探索新物體的時(shí)間多于探索舊物體的時(shí)間。與對(duì)照組比較，雄黃高劑量組小鼠的認(rèn)知功能明顯降低，而低、中劑量組無(wú)明顯差異，表明長(zhǎng)期大劑量雄黃暴露可導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能下降。暴露8周后，各雄黃組小鼠全血和腦組織中砷含量均

10、明顯升高，其中腦組織中砷含量隨雄黃暴露劑量的增加而升高，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。海馬組織中GSH水平隨著雄黃暴露劑量的逐漸增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);腦組織活性硫含量在雄黃高劑量組明顯低于對(duì)照組。透射電鏡結(jié)果顯示，各雄黃暴露組小鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞核膜局部模糊，線粒體嵴減少或空泡變性，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，突觸活性帶變短，突觸后致密物變薄，突觸前膜內(nèi)突觸小泡減少，突觸界面曲率減小;隨著雄黃暴露劑量的增加，海馬神經(jīng)元和突觸超微結(jié)構(gòu)損傷加重。

11、>　　二、雄黃對(duì)小鼠海馬谷胱甘肽合成相關(guān)因素的影響及機(jī)制研究
　　暴露8周后，雄黃中的砷可引起海馬組織中EAAT1、EAAT2 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，從而抑制Glu向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn);低、中劑量雄黃暴露時(shí)，雄黃可誘導(dǎo)海馬組織中Nrf2和HO-1表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)EAAT3、xCT、MRP-1、GCLC和GCLMmRNA和蛋白的表達(dá);同時(shí)海馬組織中γ-GT水平及海馬細(xì)胞外液中Glu和Cys的供給水平增加，引起海馬組織中GSH含量升高

12、;高劑量雄黃暴露時(shí)，海馬組織中EAAT3、xCT、MRP-1、GCLC、GCLM、Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，但EAAT3、xCT和MRP-1的蛋白表達(dá)被抑制，同時(shí)海馬組織中γ-GT水平和海馬細(xì)胞外液中Glu和Cys的供給水平降低，盡管此時(shí)γ-GCS、Nrf2的蛋白表達(dá)水平較高，但最終引起海馬組織中GSH含量減少，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。
　　三、甘草次酸對(duì)雄黃干擾小鼠海馬內(nèi)谷胱甘肽合成誘發(fā)神經(jīng)毒性的保護(hù)作用及機(jī)制研究

13、　　甘草次酸可誘導(dǎo)海馬組織中Nrf2表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)海馬組織EAAT1、EAAT2、EAAT3、xCT、MRP-1、HO-1、GCLC和GCLM mRNA和蛋白的表達(dá);同時(shí)增加海馬組織中γ-GT水平及海馬細(xì)胞外液Glu和Cys的供給水平，引起海馬組織中GSH含量升高，從而拮抗雄黃引起的海馬組織GSH含量降低，及由此導(dǎo)致的小鼠海馬神經(jīng)元和突觸超微結(jié)構(gòu)的改變以及新事物識(shí)別能力降低，減輕雄黃引起的神經(jīng)毒性作用。
　　結(jié)論：
　　1、

14、雄黃中的砷能通過(guò)血腦屏障在腦組織中蓄積，引起海馬神經(jīng)元和突觸超微結(jié)構(gòu)的異常改變，致小鼠認(rèn)知和記憶能力降低。
　　2、隨著雄黃暴露劑量的逐漸增加，海馬組織中GSH含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。
　　3、雄黃引起海馬組織中GSH含量變化的機(jī)制為:(1)低、中劑量雄黃暴露時(shí)，可誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)EAAT3、xCT、MRP-1、GCLC和GCLM的表達(dá)，進(jìn)而增加胱氨酸(Cys2)和Cys的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)GSH的合成。(2)高劑量雄

15、黃暴露時(shí)，引起EAAT1、EAAT2、EAAT3、xCT、MRP-1的蛋白表達(dá)及Glu和Cys的供給水平降低，盡管γ-GCS、Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)水平較高，最終導(dǎo)致海馬組織中GSH含量降低。
　　4、甘草次酸能改善雄黃引起的小鼠海馬神經(jīng)元和突觸超微結(jié)構(gòu)的改變以及新事物識(shí)別能力降低，對(duì)雄黃引起的神經(jīng)毒性作用有保護(hù)作用。
　　5、甘草次酸能拮抗雄黃引起的海馬組織GSH含量降低，其主要機(jī)制與調(diào)控GSH合成的前體物質(zhì)Cys和