原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元中滋補脾陰方藥抗Aβ神經(jīng)毒性的保護機制.pdf

1、目的： 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以進行性認知功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病?，F(xiàn)代研究的熱點認為β-淀粉樣蛋白(amyloid-β-peptide，Aβ)的神經(jīng)毒性在AD發(fā)病機制中起關鍵作用。Aβ能引起進行性突觸功能異常和神經(jīng)元丟失，最終導致AD中認知功能障礙和行為異常。體內(nèi)外實驗研究Aβ能直接對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，或增加神經(jīng)元對興奮毒的敏感性。突觸結(jié)構(gòu)的高度動力學可塑性及突觸傳遞中相應的

2、結(jié)構(gòu)改變是學習記憶的基礎，90％的興奮性突觸主要分布于樹突棘，樹突棘的發(fā)育和結(jié)構(gòu)變化受到調(diào)節(jié)突觸活化的分子機制的影響。突觸活化可誘導血清誘導激酶(serum-inducible kinase，SNK)靶向樹突棘相關的Rap-特異性GTPase-活化蛋白(spine-associated Rap guanosine triphosphataseactivating protein，SPAR)，通過泛素-蛋白酶體通路引起SPAR降解。SPA

3、R作為突觸后蛋白通過調(diào)節(jié)Rap信號和肌動蛋白骨架重塑來發(fā)揮調(diào)節(jié)樹突棘形態(tài)的作用。Rap活性和肌動蛋自動力學受到突觸活化調(diào)節(jié)而且與突觸可塑性有關，了解調(diào)節(jié)樹突棘肌動蛋白骨架的重塑必然有助于揭示奠定學習記憶基礎的突觸可塑性的分子機制。尚無研究報道在SNK-SPAR途徑中Aβ神經(jīng)毒性是如何發(fā)揮作用，進而引起突觸可塑性改變。同樣，N-甲基-D-門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate Receptor，NMDAR)參與突觸發(fā)生、突

4、觸傳遞、突觸可塑性、學習記憶等一系列進程。Aβ的神經(jīng)毒性能引起谷氨酸細胞外堆積，NMDAR功能異常，鈣穩(wěn)態(tài)失衡。我們推測是否Ap神經(jīng)毒性、SNK-SPAR途徑、NMDAR三者之間存在聯(lián)系。 滋補脾陰方藥(Zibu Piyin Recipe，ZBPYR)以滋補脾陰為立方原則，針對脾陰虛證而設，含藥血清是根據(jù)血清藥理學方法獲得。既往臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)ZBPYR有腦保護作用，含藥血清能明顯抗谷氨酸興奮毒，然而關于ZBPYR如何發(fā)揮神經(jīng)

5、保護作用調(diào)控突觸和樹突棘的分子機制我們還不十分清楚。 本課題的研究目的在于觀察Aβ與SNK-SPAR途徑、NMDAR之間的關系，探討ZBPYR抗Aβ神經(jīng)毒性保護神經(jīng)元的作用機制，為AD和其他神經(jīng)退行性疾病提供了新的研究思路和治療手段。 方法： 1．原代大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。 2．通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將針對SNK的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)導入神經(jīng)元中，RT-PCR檢測S

6、NKmRNA沉寂情況以及SNK沉寂時SPARmRNA表達變化。 3．將干粉Aβ1-40配制成溶液，在37℃恒溫箱中孵育72h后獲得聚集態(tài)纖維狀Aβ1-40。 4．RT-PCR觀察神經(jīng)元暴露于5μM Aβ1-40，在刺激不同時間點SNK、SPARmRNA表達變化。 5．以血清藥理學方法獲得ZBPYR含藥血清；不同濃度的ZBPYR含藥血清預處理Aβ1-40刺激的神經(jīng)元，RT-PCR檢測神經(jīng)元中SNK、SPAR、NR1

7、、NR2A、NR2BmRNA表達變化。 結(jié)果： 1．siRNA轉(zhuǎn)染入神經(jīng)元后，與對照組和RNAi對照組相比，SNKmRNA表達下調(diào)，SPARmRNA表達上調(diào)，以SNK siRNA1效果最顯著。 2．在Aβ1-40刺激神經(jīng)元不同時間點中，與對照組相比，SNKmRNA表達呈上調(diào)趨勢，SPARmRNA表達呈下調(diào)趨勢，其中在Aβ1-40刺激2h時SNK、SPARmRNA表達變化達到高峰。 3．與對照組相比，Aβ1

8、-40刺激神經(jīng)元2h后，SNKmRNA表達上調(diào)，SPAR、NR1、NR2A、NR2BmRNA表達下調(diào)。 4．Aβ1-40組相比，ZBPYR含藥血清預處理組SNKmRNA表達下調(diào)，SPAR、NR1、NR2A、NR2BmRNA表達上調(diào)，以濃度2％ZBPYR含藥血清效果最顯著。 結(jié)論： 1．siRNA對SNKmRNA表達有抑制作用，相應地SPARmRNA表達上調(diào)，表明SNK在SNK-SPAR途徑中起關鍵作用。