含雄黃血清對星形膠質細胞的毒性作用及機制研究.pdf

1、前言：
　　雄黃（Realgar）作為常用中藥其臨床應用廣泛。由于受傳統(tǒng)用藥習慣（中藥沒有不良反應或中藥無毒副作用）的影響，而未科學（長期、超量和不規(guī)范）合理使用單味雄黃或其復方制劑引起不良反應或慢性砷中毒事件時有報道，其中不少是新生兒、少兒濫用所致。動物實驗提示，砷是一種發(fā)育毒物，其在體內的代謝產物為iAs、MMA和DMA，砷可通過血腦屏障進入腦組織并蓄積，導致實驗動物的智力和認知能力等學習和記憶方面的障礙。星形膠質細胞(Ast

2、rocyte，AC)參與構成血腦屏障、神經(jīng)遞質代謝和突觸可塑性的調控。谷氨酸(Glutamate，Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）中重要的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質，廣泛參與學習記憶等一系列腦高級神經(jīng)活動，但它也具有潛在的興奮性神經(jīng)毒性，其過量釋放可引起神經(jīng)細胞的損傷，甚至死亡。Glu代謝是AC的重要功能之一。AC上表達的GLAST和GLT-1可快速攝取突觸間隙內的Glu，在AC中谷氨酰胺合成酶

3、（glutamine synthetase，GS）的作用下被轉化為谷氨酰胺。AC在調節(jié)突觸間隙內Glu水平方面起到非常關鍵的作用。因此，AC是雄黃的代謝產物通過血腦屏障進入腦組織產生損傷的初始靶細胞。
　　中藥血清藥理學方法是中藥給動物灌胃一定時間后，采集動物血液，分離血清，用含藥血清進行體外實驗。這一方法防止了中藥制劑本身理化性質對實驗的干擾，模擬了藥物在體內對細胞生物特性的影響，不僅反映了藥物中可吸收部分的直接作用，而且能反映

4、藥物在機體作用下所產生的代謝物質和藥物所誘生的機體內源性物質的間接效應。這些體內的相互作用過程都能夠被含藥血清真實地再現(xiàn)出來，實現(xiàn)了體外與體內實驗的完美結合。
　　本研究以原代培養(yǎng)的AC為受試對象，含雄黃血清為研究對象，探討雄黃對AC的影響及其機制，為揭示雄黃對CNS損傷的毒作用機制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　選取出生1～3天Wistar大鼠的仔鼠培養(yǎng)AC，GFAP免疫熒光染色法鑒定其純度。以雄黃灌胃大鼠的血清為含

5、藥血清，以羧甲基纖維素灌胃大鼠血清作為空白血清，采用氫化發(fā)生-冷肼捕集-原子吸收法測定血清中砷含量。將含雄黃血清用空白血清梯度稀釋制成含有不同濃度雄黃的含藥血清，分為六組，配制血清濃度為40％的DMEM作為培養(yǎng)基，含藥血清培養(yǎng)基（以總砷濃度計）分別為:0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L，培養(yǎng)48 h。采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)并采集圖像。采用四甲基噻唑鹽MTT

6、法檢測細胞活力。采用流式細胞儀測定AC中線粒體膜電位并采用倒置熒光顯微鏡采集圖像。采用Western blot法檢測AC中GLAST、GLT-1及GS蛋白的表達。
　　結果：
　　1、AC免疫熒光鑒定
　　GFAP免疫熒光反應陽性細胞為AC，其胞漿呈紅色，胞核為藍色。經(jīng)計數(shù)AC純度大于95％，可以進行下一步試驗研究。
　　2、含雄黃血清培養(yǎng)基的制備及總砷濃度的測定
　　分別對雄黃灌胃組和羧甲基纖維素灌胃組大

7、鼠連續(xù)灌胃三天，取血清，用氫化發(fā)生-冷阱捕集-原子吸收法測定血清中iAs、MMA、DMA的濃度。經(jīng)測定，對照組血清中含總砷為1.01μmo/L，含雄黃血清中總砷濃度為65.14μmol/L。梯度稀釋含雄黃血清，最終得到含砷濃度分別為0、5、10、15、20、25μmol/L的含雄黃血清培養(yǎng)基。
　　3、不同砷濃度含雄黃血清暴露后AC形態(tài)觀察
　　含砷濃度為5μmol/L含雄黃血清暴露組中細胞形態(tài)與對照組相比未見明顯改變。而含

8、砷濃度為10、15μmol/L的含雄黃血清暴露組中少量細胞開始脫壁，細胞間隙增大且與對照組比較少量胞體腫脹變圓，形態(tài)不規(guī)則。隨含雄黃血清暴露濃度的增加（即砷濃度的升高），脫壁細胞數(shù)量明顯增多，砷濃度為20μmol/L含雄黃血清暴露組細胞變大，突起變短或消失。砷濃度25μmol/L含雄黃血清暴露組細胞大量脫壁，細胞數(shù)量明顯減少，凋亡細胞增多，胞體腫脹圓縮明顯，突起明顯減少或消失。
　　4、不同砷濃度含雄黃血清暴露后對AC活力的影響<

9、br>　　不同砷濃度的含雄黃血清暴露組細胞活力隨含雄黃血清濃度的升高而下降，且從15μmol/L組開始均與對照組有統(tǒng)計學差異。
　　5、不同砷濃度含雄黃血清暴露后對線粒體膜電位的影響
　　不同砷濃度的含雄黃血清暴露組線粒體膜電位隨含雄黃血清中砷濃度的增加而降低，且從15μmol/L組開始，與對照組比較，均有統(tǒng)計學差異。
　　6、不同砷濃度含雄黃血清暴露后對AC內GLAST、GLT-1和GS蛋白表達的影響
　　不同

10、砷濃度的含雄黃血清暴露組AC內GLAST和GLT-1蛋白的表達隨著暴露濃度的增加而降低。其中，砷濃度25μmol/L含雄黃血清暴露組的GLAST和GLT-1蛋白含量與對照組比較有顯著性差異。GS蛋白含量與對照組相比無顯著差異。
　　結論：
　　1、大鼠灌胃雄黃三天后，血清中含有iAs、MMA和DMA。
　　2、含雄黃血清對AC具有損傷作用，可抑制GLAST和GLT-1蛋白表達，導致AC內線粒體膜電位的降低，進而誘發(fā)細胞