脂肪酸合酶調(diào)控FZD10的表達(dá)和鼻咽癌放療敏感性.pdf

1、背景與目的：鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種起源于鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在中國(guó)發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。鼻咽癌發(fā)病是由多種因素引起的，包括基因、環(huán)境、飲食以及 EBV感染等因素。鼻咽癌惡性程度較高，放療聯(lián)合化療是目前主要的治療手段，對(duì)于早期患者放療效果較好。但是對(duì)于晚期患者來說，仍有約30％的患者在治療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，放療耐受是引起治療失敗的重要原因。因此，探討腫瘤細(xì)胞放療敏感性及放療抵抗的

2、機(jī)制，尋找放射增敏點(diǎn)對(duì)提高鼻咽癌治愈率具有重大意義。
　　脂肪酸合酶（fatty acid synthase,FASN）以乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A為底物，在消耗還原性輔酶Ⅱ(NADPH)的情況下合成長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸，是脂肪酸從頭合成途徑的酶，主要合成產(chǎn)物是棕?cái)R酸。在正常成人細(xì)胞中FASN表達(dá)水平較低，而在腫瘤細(xì)胞中，由于代謝異常，需要自身合成大量脂肪酸以維持其快速生長(zhǎng)，因此FASN在許多惡性腫瘤中呈高表達(dá)。迄今為止，已在鼻咽癌、

3、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌等二十幾種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)FASN表達(dá)上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑相關(guān)，F(xiàn)ASN表達(dá)還與惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)水平可能提示患者的早期復(fù)發(fā)。FASN可能通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)，從而使癌細(xì)胞抵抗放療。近年來，F(xiàn)ASN作為治療多種腫瘤潛在的藥物作用靶點(diǎn)引起人們的關(guān)注。
　　卷曲蛋白10（frizzled class receptor10，F(xiàn)ZD10）是

4、FZD家族的成員之一。在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，當(dāng)Wnt配體不存在時(shí)，APC、Axin、GSK-3β、CK-1α等形成β-catenin降解復(fù)合物，以保持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的平衡。Wnt配體存在時(shí)，Wnt與 FZD結(jié)合，激活Dvl，激活的Dvl能夠招募Axin-GSK-3β，使β-catenin降解復(fù)合物解體，從而致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin大量積累，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的正

5、向調(diào)節(jié)因子激活下游靶基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。干擾下調(diào)FZD10可使細(xì)胞周期受抑制，使細(xì)胞增值能力下降。已有研究證實(shí)，F(xiàn)ZD10在結(jié)直腸癌、乳腺癌、滑膜肉瘤等腫瘤中都有異常高表達(dá)，有報(bào)道表明，在滑膜肉瘤細(xì)胞中，放射免疫療法結(jié)合FZD10抗體后腫瘤生長(zhǎng)受抑增加。
　　本課題擬研究FASN調(diào)控放療耐受的機(jī)制；檢測(cè)FASN抑制劑EGCG在鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性的作用。
　　方法：
　　第一部分
　　檢測(cè)FASN對(duì)NPC放

6、療敏感性的影響
　　1.從內(nèi)源性高表達(dá)FASN的鼻咽癌細(xì)胞株中，選擇CNE1和SUNE1兩株細(xì)胞，分別用shRNA沉默F(xiàn)ASN的表達(dá)，然后分別通過細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)沉默F(xiàn)ASN前后的細(xì)胞增殖速率和克隆形成率的變化；
　　2.我們前期已經(jīng)確定對(duì)EGCG對(duì)FASN有選擇性抑制作用，以及確定具有選擇性作用的濃度，以之聯(lián)合放療處理細(xì)胞，分別通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)抑制FASN前后細(xì)胞對(duì)放療的敏感性；

7、>　　3.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，將20只裸鼠隨機(jī)分為4組：A（對(duì)照）組、B（單獨(dú)放射）組、C（單獨(dú)EGCG處理）組、D（放射與EGCG聯(lián)合處理）組，從體內(nèi)驗(yàn)證抑制FASN對(duì)放射敏感性的影響。
　　第二部分
　　FASN影響放療敏感性的途徑
　　1.用沉默F(xiàn)ASN前后的CNE1細(xì)胞，通過逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(RT-PCR)以及聚丙烯酰胺凝膠電泳（Western blot），分別檢測(cè)沉默F(xiàn)ASN后FZD10蛋白及mRNA表達(dá)情況

8、；
　　2.分別用Western blot以及免疫組化方法（IHC）檢測(cè)NPC細(xì)胞系、NPC組織、移植瘤組織中FASN及FZD10的表達(dá)情況；
　　3.利用FZD10過表達(dá)質(zhì)粒及干擾序列，用低表達(dá)FASN的細(xì)胞過表達(dá)或用高表達(dá)FASN的細(xì)胞干擾FZD10后，檢測(cè)FASN的變化。
　　第三部分
　　FASN表達(dá)對(duì)NPC患者預(yù)后的影響
　　收集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院122名NPC患者病例，及其臨床病理資料，

9、采用免疫組化的方法檢測(cè)鼻咽癌組織中FASN及FZD10的表達(dá)情況，分別以得分的中位數(shù)劃分高表達(dá)組與低表達(dá)組，并用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Kaplan-Meier生存分析方法進(jìn)行總生存分析。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.我們發(fā)現(xiàn)在沉默F(xiàn)ASN表達(dá)后的細(xì)胞對(duì)放療更敏感，兩株沉默F(xiàn)ASN的細(xì)胞株增殖抑制率都明顯高于其對(duì)照細(xì)胞株；兩種NPC細(xì)胞在沉默 FASN后形成克隆的數(shù)目均少于對(duì)照組，克隆形成抑制率都

10、高于其對(duì)照細(xì)胞，并且隨著放射強(qiáng)度的增加，細(xì)胞克隆形成抑制率增加，P<0.05，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　2.用EGCG聯(lián)合放射處理細(xì)胞后，兩株細(xì)胞放療敏感性均有明顯變化，細(xì)胞增殖速率以及克隆形成率均降低，加入 EGCG后細(xì)胞對(duì)放射更敏感，且藥物相互作用系數(shù)均在0.9-1.1之間，兩者具有加合作用；
　　3.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B、C兩組與A組相比腫瘤均減小。并且，D組與C組相比，腫瘤明顯減小，說明單獨(dú)放射或者單獨(dú)EGCG處

11、理都對(duì)腫瘤有抑制作用，并且抑制FASN后，腫瘤生長(zhǎng)抑制效果明顯增加，且兩者具有加合作用。
　　第二部分
　　1.沉默F(xiàn)ASN表達(dá)后，Wnt通路上的蛋白FZD10不論是在RNA水平還是蛋白質(zhì)水平都有很大程度的降低；
　　2.NPC細(xì)胞系、NPC組織以及移植瘤組織中FASN高表達(dá)時(shí)FZD10高表達(dá)，F(xiàn)ASN低表達(dá)時(shí)FZD10同樣也低表達(dá)；
　　3.過表達(dá)或者干擾FZD10表達(dá)后，F(xiàn)ASN表達(dá)無變化，提示FASN是FZ

12、D10的上游蛋白。
　　第三部分
　　FASN時(shí)鼻咽癌獨(dú)立的預(yù)后因子，F(xiàn)ASN陰性患者或FZD10陰性患者生存期比FASN陽性或FZD10陽性患者長(zhǎng)，F(xiàn)ASN陰性和FZD10陰性患者總生存期最長(zhǎng)、預(yù)后最好。
　　結(jié)論：
　　1.沉默/抑制FASN提高鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性；
　　2.FZD10的表達(dá)受FASN的調(diào)控并引起鼻咽癌放療抵抗；
　　3.FASN是鼻咽癌獨(dú)立的不良預(yù)后因子，F(xiàn)ASN陰性和FZD