草氨酸鈉抑制乳酸脫氫酶對鼻咽癌生長及放射敏感性的影響.pdf

1、目的：
　　研究草氨酸鈉作為乳酸脫氫酶(LDH)抑制劑對人鼻咽癌生長及其放射敏感性的影響,探討抑制糖代謝對鼻咽癌的治療作用,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　選用鼻咽癌CNE-1、CNE-2細(xì)胞系作為研究對象,同時在Balb/c裸鼠進(jìn)行CNE-1移植瘤實(shí)驗(yàn)。
　　(1)采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測草氨酸鈉對鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2生長的影響。
　　(2)采用傷口愈合試驗(yàn)觀察草氨酸鈉抑制L

2、DH對鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的影響, transwell小室侵襲試驗(yàn)觀察草氨酸鈉對鼻咽癌侵襲能力的影響。并采用Western blot檢測遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　(3)采用流式細(xì)胞術(shù)觀察草氨酸鈉對鼻咽癌細(xì)胞周期的影響,磷脂酰絲氨酸外翻法(AnnexinⅤ和PI雙染法)檢測草氨酸鈉對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　(4)采用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒,輔酶ⅡNADP(H)含量測定試劑盒,ATP含量

3、檢測試劑盒等,檢測草氨酸鈉對鼻咽癌細(xì)胞中LDH、ROS、NADP(H)及ATP等能量代謝指標(biāo)變化的影響。
　　(5)采用Western blot法檢測草氨酸鈉對鼻咽癌細(xì)胞中周期凋亡相關(guān)蛋白及其它蛋白表達(dá)的變化的影響。
　　(6)細(xì)胞克隆形成法檢測草氨酸鈉對鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響,并采用細(xì)胞流式術(shù)檢測草氨酸鈉聯(lián)合X射線對鼻咽癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。
　　(7)采用γH2AX免疫熒光檢測照射后DNA損傷情況,Wes

4、tern blot用于進(jìn)一步檢測草氨酸鈉對照射后細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的影響。
　　(8)在Balb/c裸鼠上進(jìn)行CNE-1移植成瘤試驗(yàn),并觀察草氨酸鈉聯(lián)及放療單獨(dú)及聯(lián)合的作用,在體內(nèi)評價抑制LDH在鼻咽癌治療中的作用。
　　結(jié)果：
　　(1)草氨酸鈉對鼻咽癌(NPC)具有明顯的增殖抑制作用,在CNE-1細(xì)胞中,在24h、48h、72h時,草氨酸鈉的50％抑制生長濃度(IC50)分別是74.6mmol/L,32.

5、4mmol/L和17.8mmol/L,而在CNE-2中,不同時間的IC50分別是62.3mmol/L,44.5mmol/L,31.6mmol/L。
　　(2)在鼻咽癌細(xì)胞中,當(dāng)LDH酶受到抑制后,糖酵解通路受到干擾,隨著草氨酸鈉濃度的增加,兩種細(xì)胞內(nèi)的LDH酶的活性均明顯下降,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　(3)抑制LDH酶后,鼻咽癌的侵襲能力同樣受到了明顯的抑制,抑制程度與劑量呈現(xiàn)良好的正相關(guān)。MMP-2、MMP9、VEG

6、F下調(diào),而E-cadherin、β-cadherin增加。
　　(4)草氨酸鈉可引起NPC細(xì)胞G2/M期阻滯。誘導(dǎo)的G2/M期阻滯可能是通過調(diào)節(jié)cyclinB1和CDK1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　(5)草氨酸鈉抑制LDH酶后,鼻咽癌細(xì)胞確實(shí)發(fā)生了不同程度的凋亡,且與處理濃度及時間具有良好的相關(guān)性。草氨酸鈉處理后線粒體膜電位下降,線粒體凋亡途徑在這種凋亡過程中扮演著重要的角色。
　　(6)草氨酸鈉抑制LDH后可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞中

7、ROS的爆發(fā)。ROS是其抑制鼻咽癌細(xì)胞生長的作用中扮演著重要的角色,且當(dāng)這種抑制作用可被ROS清除劑所緩解。
　　(7)草氨酸鈉對鼻咽癌CNE-1和CNE-2均具有明顯的放射增敏作用,增敏比分別為1.26和1.37,并且草氨酸鈉可增加照射后誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡的比例。
　　(8)照射后,鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生了顯著的G2/M期阻滯,也表明當(dāng)加入草氨酸鈉后,細(xì)胞的G2/M期阻滯更加嚴(yán)重,說明草氨酸鈉與電離輻射對細(xì)胞周期阻滯具有一定的協(xié)同作

8、用。
　　(9)加入草氨酸鈉后,照射后細(xì)胞中的γH2AX位點(diǎn)明顯增多,意味著當(dāng)加入草氨酸鈉后, CNE-1細(xì)胞的DNA受到的損傷更為嚴(yán)重。
　　(10)當(dāng)加入LDH酶抑制劑草氨酸鈉后,電離輻射誘導(dǎo)的DNA修復(fù)蛋白DNA-PKcs、Ku70、Ku80和XRCC4等的表達(dá)受到了明顯的抑制。
　　(11)在動物水平上進(jìn)一步證實(shí)了草氨酸鈉可抑制鼻咽癌生長及提高其放射敏感性,更重要的是,抑制LDH-A后,在小鼠體內(nèi)可觀察到明顯的

9、毒性。
　　結(jié)論：
　　(1)草氨酸鈉可有效地抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長及能量代謝;
　　(2)草氨酸鈉可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲;
　　(3)草氨酸鈉可通過降低cyclin B1/CDK1的表達(dá)顯著誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞G2/M期阻滯;
　　(4)草氨酸鈉可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā),并通過OXPHOS引起線粒體途徑凋亡;
　　(5)草氨酸鈉可增加鼻咽癌的放射敏感性,其機(jī)制與ROS增加細(xì)胞凋亡并且抑制DNA