沉默F(xiàn)ANCD2表達提高人鼻咽癌細胞放療敏感性的實驗研究.pdf

1、目的：鼻咽癌是來源于鼻咽部黏膜上皮的一種惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織分型標(biāo)準，可分為角化型和非角化型鱗癌、分化型非角化癌、未分化癌。我國是鼻咽癌的高發(fā)國家之一，南方的發(fā)病率又高于北方，且以未分化癌為主。放射治療是鼻咽癌的主要治療方式，臨床療效良好，但仍有部分患者會產(chǎn)生放療抵抗，再次放療效果不佳。FANCD2基因是范科尼貧血家族中的一員，該家族基因參與了DNA損傷修復(fù)，構(gòu)成范科尼貧血通路，F(xiàn)ANCD2在該通路中起核心作用。項目組在前期研究中

2、，檢測發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)鼻咽癌患者FANCD2蛋白表達量增高，推測其參與了鼻咽癌放療抵抗。在此基礎(chǔ)上，本實驗擬通過細胞實驗了解沉默F(xiàn)ANCD2表達對放療前后細胞克隆形成、增殖、周期、凋亡等的影響，探索沉默F(xiàn)ANCD2表達提高鼻咽癌CNE-2細胞放療敏感性的可能性。
　　方法：以鼻咽癌CNE-2細胞作為研究對象，采用RPMI-1640培養(yǎng)基+10％胎牛血清，于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗細胞分為三組：未做任何干預(yù)的野生型

3、CNE-2細胞；含有無效序列的對照組細胞CNE-2NC；含有shRNA-FANCD2干擾序列的實驗組細胞CNE-2sh。
　?。?）構(gòu)建穩(wěn)定細胞株，用慢病毒感染CNE-2細胞，在熒光顯微鏡下觀察感染效率，嘌呤霉素進行藥物篩選一周以上，至無新的死亡細胞為止，獲得沉默F(xiàn)ANCD2表達的穩(wěn)定細胞株CNE-2sh和含有無效序列的對照組穩(wěn)定細胞株CNE-2NC。提取三組細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR實驗檢測FANCD

4、2 mRNA的表達量；提取三組細胞的總蛋白，利用Western Blot實驗檢測FANCD2蛋白的表達量；
　?。?）平板克隆實驗，將三組細胞CNE-2、CNE-2NC、CNE-2sh接種于6孔板，經(jīng)過0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy劑量放療，放療后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)7-14天，待細胞生長至肉眼可見的直徑約0.1-0.3cm克隆后，終止培養(yǎng)，使用多聚甲醛固定細胞，染色、漂洗，晾干后拍照、觀察、計數(shù)。在倒置顯微鏡下對每大于

5、50個細胞的克隆進行計數(shù)，計算克隆形成率，使用多靶單擊模型和線性二次模型進行擬合，得到存活分數(shù)，計算放療生物學(xué)相關(guān)參數(shù)；
　?。?）細胞增殖實驗，上述三組細胞接種于96孔板中，在經(jīng)過0Gy和6Gy劑量放療后繼續(xù)培養(yǎng)，放療后第24、48、72、96小時，在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測每個孔的光密度值，繪制出細胞增殖曲線；
　　（4）細胞凋亡檢測，上述三組細胞接種于6孔板中，在經(jīng)過0Gy和6Gy劑量放療后繼續(xù)培養(yǎng)72小時，終止培養(yǎng)，按細

6、胞凋亡檢測試劑盒說明書進行Annexin V-PE和7AAD染色后在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率；
　　（5）細胞周期檢測，上述三組細胞接種于6cm培養(yǎng)皿中，在經(jīng)過0Gy和6Gy劑量放療后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，終止培養(yǎng)，按細胞周期檢測試劑盒說明書進行PI染色后在流式細胞儀上檢測細胞周期。
　　結(jié)果：
　?。?）沉默效率驗證結(jié)果，熒光定量 PCR結(jié)果顯示三組細胞FANCD2 mRNA的相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=75.0

7、35,P＜0.05）, CNE-2sh組中FANCD2 mRNA表達量（0.254±0.072）顯著低于CNE-2組（1.000±0.000）和CNE-2NC組（0.690±0.078）；Western Blot結(jié)果顯示三組細胞中的FANCD2蛋白相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2450.370,P＜0.05）。CNE-2sh組中FANCD2蛋白表達量（0.130±0.025）顯著低于CNE-2組（1.672±0.028）和CNE-2

8、NC組（1.336±0.013），沉默效率為92.20%；
　?。?）平板克隆形成實驗結(jié)果，未經(jīng)過放療（0Gy）時三組細胞之間克隆形成率無統(tǒng)計學(xué)差異（F=0.600,P＞0.05）；經(jīng)過放療（2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy）后三組細胞之間的克隆形成率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計值分別為（F=49.132,P＜0.05）、（F=590.113,P＜0.05）、（F=286.798,P＜0.05）、（F=77.167,P＜0.

9、05）、（F=27.000,P＜0.05），放療后CNE-2sh組的細胞克隆形成率顯著小于CNE-2組和CNE-2NC組；細胞存活曲線顯示CNE-2sh組的生存曲線較CNE-2組和CNE-2NC組下移，多靶單擊模型擬合得到放療增敏比=1.44，線性二次模型擬合得到放療增敏比=1.18，放療增敏比均＞1；
　?。?）細胞增殖實驗結(jié)果，未經(jīng)過放療(0Gy)的情況下，在0h、24h、48h時CNE-2sh組光密度值與CNE-2和CNE-

10、2NC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計值分別為（F=0.303,P＞0.05），（F=0.193,P＞0.05），（F=0.067,P＞0.05），在72h、96h時，三組細胞的光密度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計值分別為（F=24.148,P＜0.05），（F=15.029,P＜0.05），CNE-2sh組的光密度值（0.342±0.018，0.671±0.045）顯著小于CNE-2組（0.453±0.019，0.900±0.017）和CNE-

11、2NC組（0.411±0.022，0.825±0.075）；經(jīng)過放療(6Gy)后0h、24h、48h的CNE-2sh組光密度值與CNE-2組和CNE-2NC組之間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計值分別為（F=0.172，P＞0.05）、（F=1.224,P＞0.05）、（F=0.444,P＞0.05），在72h、96h時，三組間細胞光密度值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計值分別為（F=88.598,P＜0.05），（F=77.371,P＜0.05），

12、CNE-2sh組光密度值（0.300±0.009,0.411±0.020）弱于CNE-2組（0.443±0.018,0.634±0.027）和CNE-2NC組（0.402±0.012,0.574±0.021）；
　　（4）細胞凋亡實驗結(jié)果，未經(jīng)過放療時，三組細胞間的細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.218,P＞0.05）， CNE-2sh組的細胞凋亡率（4.90±0.21）顯著高于CNE-2組（3.36±0.89）和CNE-2

13、NC組（3.09±0.59）；經(jīng)過放療（6Gy）后，三組細胞間的細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=30.872,P＜0.05），CNE-2sh組細胞凋亡率（19.05±1.99）顯著高于CNE-2組（11.26±0.85）和CNE-2NC組（11.08±1.17）；
　?。?）細胞周期實驗結(jié)果，三組細胞在未經(jīng)過放療時細胞周期主要分布在G1期和S期，G2期細胞較少，三組細胞在G1期、S期、G2期的比例差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計值分別

14、為（F=7.555,P＜0.05），（F=19.382,P＜0.05），（F=27.031,P＜0.05）。CNE-2sh組在G1期（38.54±1.29）、S期（41.06±1.24）的比例顯著大于CNE-2組（33.78±2.03）、（37.70±0.75）和CNE-2NC組（34.24±1.55）、（36.48±0.72），在G2期的比例（20.07±1.52）顯著少于CNE-2組（28.28±1.58）和CNE-2NC組（29.

15、94±2.12）；經(jīng)過放療后三組細胞的細胞周期分布發(fā)生改變，G1期、S期細胞減少，G2期細胞增加，在CNE-2sh與CNE-2和CNE-2NC三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計值分別為（F=26.785,P＜0.05）、（F=10.571,P＜0.05）、（F=39.523,P＜0.05），CNE-2sh組在G1期（13.64±1.93）、S期（16.56±3.39）的比例顯著小于CNE-2組（21.37±1.19）、（24.72±1.5

16、3）和CNE-2NC組（21.66±1.35）、（22.86±1.32），在G2期的比例（66.60±0.74）顯著大于CNE-2組（53.91±2.70）和CNE-2NC組（55.47±1.75）。
　　結(jié)論：
　?。?）shRNA干擾能夠獲得穩(wěn)定沉默F(xiàn)ANCD2表達的鼻咽癌CNE-2細胞（CNE-2sh），沉默效率達到預(yù)期；
　?。?）沉默F(xiàn)ANCD2表達后能夠抑制鼻咽癌CNE-2細胞放療后的克隆形成率；
　

17、　（3）通過多靶單擊模型和線性二次模型擬合后計算獲得放療增敏比>1，提示沉默F(xiàn)ANCD2表達能夠提高鼻咽癌CNE-2細胞的放療敏感性；
　?。?）沉默F(xiàn)ANCD2表達后能夠顯著抑制鼻咽癌CNE-2細胞放療前、后的細胞增殖；
　?。?）沉默F(xiàn)ANCD2表達后能夠顯著促進鼻咽癌CNE-2細胞放療前、后的細胞凋亡；
　?。?）沉默F(xiàn)ANCD2表達后能夠顯著改變鼻咽癌CNE-2細胞的細胞周期分布，放療后使阻滯在G2期的細胞顯著