系統(tǒng)歸巢的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在類牙髓樣組織再生過程中的作用研究.pdf

1、背景和目的
　　牙髓病、根尖周病會(huì)伴隨著牙髓的感染或壞死。作為臨床髓病治療的首選方法，根管治療可以通過有效的控制炎癥從而緩解病人的痛苦。但是其缺點(diǎn)在于經(jīng)過根管治療的牙齒就會(huì)徹底失去牙髓，失去神經(jīng)血管的營養(yǎng)作用，隨著時(shí)間的推移會(huì)變色，變脆，易折，抗力強(qiáng)度明顯降低。因此如何讓牙髓再生成為髓病研究的重中之重。
　　在牙髓再生的眾多研究方法中，外源性干細(xì)胞移植獲取牙髓再生是其中一個(gè)重要的研究方向。目前，已有若干的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，通過移

2、植外源性干細(xì)胞可以獲取類牙髓樣組織的再生。雖然干細(xì)胞移植所取得的研究結(jié)果讓人振奮，但是其往臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化卻面臨著巨大的困難及挑戰(zhàn)。一方面，干細(xì)胞的提取與培養(yǎng)，干細(xì)胞的體外擴(kuò)增及儲(chǔ)存等程序相當(dāng)復(fù)雜，另一方面，干細(xì)胞的植入方式、手段和劑量標(biāo)準(zhǔn)、免疫反應(yīng)以及干細(xì)胞移植所引起的倫理等一系列的問題都是不可避免的，最后，還有一個(gè)不可忽視的問題便是干細(xì)胞移植所產(chǎn)生的高額費(fèi)用。從口腔醫(yī)師的視角分析，在牙髓病的治療策略上，尋找較為實(shí)用和經(jīng)濟(jì)的方法應(yīng)該是我

3、們未來研究的方向。
　　在總結(jié)國內(nèi)外最新研究成果的基礎(chǔ)上，通過讓內(nèi)源性細(xì)胞歸巢來替代外源性細(xì)胞移植，從而避免體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)細(xì)胞移植等復(fù)雜的程序而獲取牙髓再生成為新的研究焦點(diǎn)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMSCs)作為一種可以向多種組織細(xì)胞分化的多能的干細(xì)胞，已被證實(shí)可以感受外界信號(hào)刺激，趨化至機(jī)體的受損部位，同時(shí)進(jìn)一步發(fā)生細(xì)胞分化而發(fā)揮其治療作用?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（Stromal cel

4、l-derived factor-1，SDF-1）是一類對(duì)干細(xì)胞尤其是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的遷移有明顯的趨化作用的趨化蛋白，可以與干細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合形成偶連分子對(duì)，通過偶連分子對(duì)調(diào)控細(xì)胞的粘附、運(yùn)動(dòng)、分泌、增殖等生物學(xué)行為。眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí)在心肌梗死、腦損傷、骨折及肺損傷等情況下，損傷區(qū)域的SDF-1表達(dá)會(huì)上調(diào)，而表達(dá)上調(diào)的SDF-1則可以募集MSCs遷移至損傷區(qū)域并修復(fù)損傷。
　　我們?cè)O(shè)想機(jī)體內(nèi)系統(tǒng)性來源的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能否感受到

5、信號(hào)刺激，遷移并歸巢到根管內(nèi)，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞分化從而參與牙髓的再生。為了對(duì)我們的設(shè)想進(jìn)行驗(yàn)證，我們首先通過綠色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)(GFP)對(duì)獲取的狀態(tài)良好的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。GFP無需反應(yīng)底物便能產(chǎn)生熒光，優(yōu)點(diǎn)是性質(zhì)穩(wěn)定、敏感度高、無毒性副作用。我們通過小鼠的鼠尾靜脈將GFP+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，將含有SDF-1的膠原人牙根置于小鼠的皮下袋內(nèi)，通過組織學(xué)觀察是否會(huì)有類牙髓樣的新生組織在根管內(nèi)出現(xiàn);利用GFP的示蹤功能首次探

6、討系統(tǒng)性的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是否可以歸巢至根管內(nèi)并參與牙髓樣組織的再生過程;利用免疫熒光顯微鏡、免疫組化染色等方法觀測(cè)GFP+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在新生的類牙髓樣組織中的分布及其可能出現(xiàn)的分化，評(píng)估外源性SDF-1促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向根管的歸巢并促進(jìn)牙髓再生的能力。
　　材料與方法
　　1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
　　我們使用的是ST2小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。首先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，并穩(wěn)定傳代。傳代后首先對(duì)最適感染復(fù)數(shù)進(jìn)行確定。當(dāng)感染

7、復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection MOI)大于等于60時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光表達(dá)率可明顯達(dá)到最高，故將60確定為最適感染復(fù)數(shù)。然后確定G418的最適篩選濃度。將細(xì)胞培養(yǎng)在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基中10-14天，當(dāng)G418濃度大于200μ g/mL后細(xì)胞全部死亡，故確定G418的最適篩選濃度和維持濃度分別為200μ g/mL和100μ g/mL。慢病毒感染BMSCs，經(jīng)G418篩選后，可獲取GFP穩(wěn)定表達(dá)的陽性B

8、MSCs細(xì)胞，而后體外大量擴(kuò)增備用。
　　2.小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的尾靜脈移植及動(dòng)物模型的建立
　　收集離體正畸拔除的單根管第一前磨牙，于冠根聯(lián)合處沿近遠(yuǎn)中向截?cái)嘌栏?，行根管預(yù)備，根尖孔擴(kuò)大至直徑0.5毫米。將牙根用次氯酸鈉、EDTA、無菌PBS進(jìn)行系列預(yù)處理后，置于含有雙抗的PBS中備用。收集體外擴(kuò)增的GFP+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，移植組每只小鼠將100μ L細(xì)胞懸液（1×106細(xì)胞）經(jīng)尾靜脈注射移植入小鼠體內(nèi)，對(duì)照組注射100μ

9、 L不含血清的α-MEM培養(yǎng)液。在背部皮膚作一個(gè)長約1cm縱向切口，然后用止血鉗鈍性分離，暴露皮下組織，形成皮下袋，54只雄性5-7周齡小鼠，隨機(jī)分為三組:SDF-1組（置入皮下袋的牙根根管內(nèi)含有融入100ng/mL的SDF-1的中性三維膠原+尾靜脈移植GFP+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞），SDF-1空白組（置入皮下袋的牙根根管內(nèi)僅含有中性三維膠原+尾靜脈移植GFP+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞），對(duì)照組（置入皮下袋的牙根根管內(nèi)僅含有中性三維膠原+尾靜脈注射α-

10、MEM培養(yǎng)液）。牙根置入小鼠皮下袋內(nèi)并嚴(yán)密縫合，三周后處死小鼠獲取牙根標(biāo)本。進(jìn)行蘇木精和伊紅(HE)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察根管內(nèi)類牙髓樣的新生組織，同時(shí)對(duì)新生組織內(nèi)新生血管的面積進(jìn)行測(cè)量并比較，以評(píng)價(jià)SDF-1對(duì)血管再生的作用。切片脫蠟水化后，用DAPI染色細(xì)胞核并通過熒光顯微鏡直接觀測(cè)GFP+細(xì)胞在根管內(nèi)新生類牙髓樣組織中的分布情況，利用圖像處理軟件檢測(cè)移植GFP+細(xì)胞的歸巢率，評(píng)價(jià)SDF-1對(duì)移植細(xì)胞歸巢的作用;用免疫組化染色的方

11、法檢測(cè)GFP+細(xì)胞在類牙髓樣新生組織中的分布及可能的分化，并檢測(cè)類牙髓樣的新生組織中堿性磷酸酶（硬組織礦化指標(biāo)）的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
　　ST2細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇并穩(wěn)定傳代后，選取狀態(tài)良好的BMSCs細(xì)胞，利用攜帶GFP基因的慢病毒感染細(xì)胞，可通過熒光顯微鏡直接觀察轉(zhuǎn)染效果。48小時(shí)左右即可觀察到綠色熒光的出現(xiàn)，72-96小時(shí)綠色熒光達(dá)到最強(qiáng)，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。轉(zhuǎn)染后的BMSCs

12、細(xì)胞生長狀態(tài)依然良好，形態(tài)并未發(fā)生明顯改變;經(jīng)過G418篩選后，BMSCs細(xì)胞生長狀態(tài)未受影響。篩選后將獲得的GFP+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增，隨著細(xì)胞傳代，GFP+細(xì)胞生長狀態(tài)良好，GFP表達(dá)穩(wěn)定。
　　2.動(dòng)物模型中GFP+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的歸巢及根管內(nèi)類牙髓樣新生組織的形成
　　對(duì)照組中僅存有膠原組織，未觀測(cè)到成形細(xì)胞和血管的存在。在SDF-1組及SDF-1空白組中，均出現(xiàn)了類牙髓樣組織的再生、新生血管的形成、綠色熒光

13、蛋白及堿性磷酸酶的陽性表達(dá)。SDF-1空白組中，光學(xué)顯微鏡下我們可以看到殘余的膠原纖維成網(wǎng)格狀排列，網(wǎng)格中有少量細(xì)胞存在，同時(shí)視野中有少量的新生血管。倒置熒光顯微鏡下可觀測(cè)到少量的GFP+細(xì)胞（綠漿藍(lán)核），免疫組化染色顯示綠色熒光蛋白和堿性磷酸酶的表達(dá)比較微弱。在SDF-1組中，網(wǎng)格狀的膠原支架基本消失，代替它的是大量的細(xì)胞和新生血管，歸巢的GFP+細(xì)胞數(shù)總量、新生血管的面積明顯大于SDF-1空白組，綠色熒光蛋白及堿性磷酸酶的表達(dá)明顯強(qiáng)

14、于SDF-1空白組，SDF-1組與SDF-1空白組之間的GFP(IOD)及ALP(IOD)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　1.攜帶GFP的慢病毒能夠高效轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染后的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以穩(wěn)定而持久表達(dá)GFP，能于體外大量擴(kuò)增。
　　2.可通過內(nèi)源性細(xì)胞歸巢的方式獲取類牙髓樣組織的再生。
　　3.機(jī)體內(nèi)系統(tǒng)性來源的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以歸巢到根管內(nèi)并參與類牙髓樣組織再生及分化。
　　4.SDF-