骨髓間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記及再生腎樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：建立PKH26、DAPI標(biāo)記骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cell，MSC)，的方法，并探討標(biāo)記MSC的基本生物學(xué)活性；SD大鼠經(jīng)50％的甘油肌內(nèi)注射建立大鼠急性腎功能衰竭(acute renalfailure，ARF)模型，評價經(jīng)尾靜脈注射的MSC對大鼠APF的治療效果及體內(nèi)外初步探討其可能機(jī)制。 方法: MSC按PKH26、DAPI標(biāo)記程序進(jìn)行標(biāo)記后培養(yǎng)，采用激光共聚焦顯微鏡(confocol)、流式

2、細(xì)胞分析儀(FCM)等觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和熒光標(biāo)記活性變化；應(yīng)用RT-PCR檢測標(biāo)記后MSC的mucleostemin及Bmi-1基因的表達(dá)；選用堿性磷酸酶(ALP)染色、von kossa染色及骨形成蛋白3(BMP3)基因表達(dá)分析等技術(shù)，觀察標(biāo)記后MSC體外分化成骨細(xì)胞的特性；SD大鼠經(jīng)50％的甘油肌內(nèi)注射建立大鼠ARF模型，尾靜脈注射MSC，綜合運(yùn)用臨床生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫組織化學(xué)、病理學(xué)、熒光原位雜交(FISH)等技術(shù)，評價M

3、SC的治療效果并找尋修復(fù)腎損傷的機(jī)制。體外利用Transwell培養(yǎng)板將大鼠MSC與受損腎組織共培養(yǎng)，運(yùn)用confocol、RT-PCR、巢式PCR、熒光定量PCR鑒定細(xì)胞是否能分化為腎小管樣上皮細(xì)胞，進(jìn)一步佐證MSC的治療修復(fù)機(jī)制。 結(jié)果: PKH26標(biāo)記后細(xì)胞呈紅色熒光，DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，熒光的強(qiáng)度隨著熒光染料濃度的增加而遞增，并與傳代時間和代數(shù)相關(guān)；標(biāo)記后細(xì)胞生長狀態(tài)良好，基本生長特性如傳代培養(yǎng)和生長曲線無明

4、顯改變；細(xì)胞nucleostemin及Bmi-1基因表達(dá)未見改變；標(biāo)記MSC誘導(dǎo)后ALP、Von kossa染色陽性，呈現(xiàn)典型的成骨細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特征，并表達(dá)：BMP3基因；成功建立大鼠ARF模型，ARF大鼠腎組織內(nèi)具有較多的外源MSC，其他組織如心、肝、肺、腦也可見少量的外源MSC；利用胎兒MSC進(jìn)行的定位實(shí)驗(yàn)中，在大鼠的心、肝及不同腎臟部位擴(kuò)增出人17α衛(wèi)星DNA序列。FISH實(shí)驗(yàn)顯示大鼠冰凍腎臟切片中可見人源性細(xì)胞。MSC實(shí)驗(yàn)組

5、大鼠血清肌酐、尿素氮下降水平較對照組具有明顯的差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟恢復(fù)情況較對照組有明顯改善。體外共培養(yǎng)后，大鼠MSC形態(tài)由長梭形變?yōu)閳A形，并且高表達(dá)上皮細(xì)胞特異性基因CK18和腎小管上皮細(xì)胞特異性基因AQP1。結(jié)論 PKH26、DAPI可穩(wěn)定標(biāo)記大鼠骨髓MSC并能傳代培養(yǎng)，標(biāo)記后細(xì)胞形態(tài)、生長活力及多向分化潛能等無明顯影響，該技術(shù)可用于追蹤MSC轉(zhuǎn)歸、可塑性及干細(xì)胞移植方面的實(shí)驗(yàn)研究；外源MSC體內(nèi)能夠歸巢到受損腎臟，