高脂血癥對靜脈移植的骨髓基質(zhì)干細胞歸巢及骨再生的影響.pdf

1、背景和目的:
　　口腔頜面部的骨缺損多由良惡性腫瘤、手術、創(chuàng)傷以及炎癥（例如牙周炎、骨髓炎）等引起，不但導致患者的面部畸形和功能障礙，還會產(chǎn)生嚴重的心理、社交障礙，影響患者的生活質(zhì)量。理想的骨缺損修復是實現(xiàn)骨組織的再生，恢復健康骨組織的解剖結構和生理功能。骨損傷的愈合是一個復雜的組織學和生物化學變化過程，多種細胞和分子參與其中。在損傷后的第一個24小時內(nèi)，血小板、巨噬細胞以及其他炎癥細胞釋放各種細胞因子和生長因子，募集間充質(zhì)干細胞

2、(mesenchymal stem cells，MSCs)到受損區(qū)域。這些間充質(zhì)干細胞進一步增殖分化為成骨細胞和成軟骨細胞，最終導致細胞外基質(zhì)的的積聚及礦化。間充質(zhì)干細胞屬于多能干細胞，具有自我復制和多向分化能力，可以在特定條件下轉(zhuǎn)變成為一種或多種構成人體組織或器官的細胞。間充質(zhì)干細胞主要存在于結締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。參與骨再生的間充質(zhì)干細胞可能來源于缺損臨近組織例如骨膜、骨髓、血管壁等，也可能由較遠區(qū)域的骨髓組

3、織通過血液循環(huán)遷移至此，另外外周血中也存在少量間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞的激活、募集對骨損傷后的再生至關重要。
　　骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells，BMSCs)是一種多能干細胞，具有很強的自我更新能力，能夠分化為多種中胚層組織如脂肪組織、骨組織、軟骨、韌帶、肌肉等。作為成骨前體細胞，骨髓基質(zhì)干細胞在骨組織形成過程中發(fā)揮著重要作用。干細胞通過血液循環(huán)穿過血管內(nèi)皮細胞甚至是經(jīng)過長距離的遷移到達特定部位的過

4、程稱之為“歸巢”。大量研究表明，間充質(zhì)干細胞會選擇性的歸巢至機體任何損傷部位以發(fā)揮治療作用，確切機理尚不清楚。盡管越來越多的證據(jù)顯示細胞因子和趨化因子（以及他們的受體）可能在間充質(zhì)干細胞的動員、歸巢過程中發(fā)揮著重要的作用，但鮮有研究關注干細胞歸巢與全身健康狀況的關系。
　　高脂血癥與骨質(zhì)疏松密切相關。高脂血癥通過抑制骨形成和促進骨吸收導致骨質(zhì)疏松，氧化應激和脂質(zhì)過氧化在其中起重要作用。脂質(zhì)氧化物能夠促進成骨細胞的凋亡以及破骨細胞的

5、分化;骨髓基質(zhì)干細胞在體外經(jīng)過低密度脂蛋白的氧化產(chǎn)物誘導，能夠分化為脂肪細胞而不是成骨細胞。目前高脂血癥對骨創(chuàng)傷愈合的影響還不明確，但已有研究顯示高脂血癥抑制骨創(chuàng)傷部位的新骨形成。因此我們推測:除了對骨代謝的負性影響外，高脂血癥還可能會通過干擾間充質(zhì)干細胞的歸巢行為影響骨創(chuàng)傷的愈合。
　　本實驗利用載脂蛋白E基因敲除（Apolipoprotein E deficient，ApoE-/-）小鼠建立高脂血癥模型。在小鼠下頜骨制造骨缺損

6、后，經(jīng)過小鼠尾靜脈注射攜帶綠色熒光蛋白的骨髓基質(zhì)干細胞，利用免疫熒光顯微鏡觀察、免疫組化染色、組織學觀察以及組織形態(tài)學分析等方法首次探討了高脂血癥對系統(tǒng)移植的骨髓基質(zhì)干細胞的歸巢和骨再生的影響。
　　材料與方法:
　　1.骨髓基質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和轉(zhuǎn)染
　　本實驗采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)C57BL/6J小鼠來源的骨髓基質(zhì)干細胞;采用換液、粘附-消化-傳代-粘附的方法獲得高純度的骨髓基質(zhì)干細胞。通過流式細胞儀檢測

7、第4代骨髓基質(zhì)干細胞表面抗原CD34，CD44，CD45，CD29的表達。成纖維細胞克隆形成單位(CFU-F)實驗檢測骨髓基質(zhì)干細胞的克隆形成能力。三向分化能力鑒定:在體外以0.1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸鈉、50mg/L抗壞血酸磷酸鹽誘導骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，4周后進行茜素紅染色鑒定鈣化結節(jié)的形成;以1μM地塞米松、200μM吲哚美辛、10μM胰島素和0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤誘導骨髓基質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化

8、，2周后用油紅O(OilRedO)染色檢測脂肪滴的形成;以10ng/ml轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、50nM抗壞血酸磷酸鹽、0.1μM地塞米松誘導骨髓基質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化，3周后通過甲苯胺藍染色檢測軟骨特異性蛋白聚糖的形成;體外分化誘導實驗以不含誘導因子的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的同代骨髓基質(zhì)干細胞為對照。利用攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein

9、，GFP)基因的慢病毒載體感染骨髓基質(zhì)干細胞，經(jīng)G418篩選陽性細胞后體外擴增備用。
　　2.高脂血癥模型的建立及小鼠骨髓基質(zhì)干細胞的移植
　　7周齡ApoE-/-小鼠和C57BL/6J小鼠均飼以高脂飲食，每周監(jiān)測體重，并于高脂喂養(yǎng)4周后檢測血脂水平以確定高脂模型是否建立。小鼠13周齡時，在其右側下頜骨制造直徑為1.5mm的缺損;收集體外擴增的GFP+骨髓基質(zhì)干細胞并經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，每只小鼠接受的細胞移植量為1×10

10、6個，對照組僅注射不含血清的α-MEM培養(yǎng)液。術后1，2，4周處死小鼠，經(jīng)4％多聚甲醛循環(huán)內(nèi)固定后解剖出小鼠右側下頜骨。下頜骨標本經(jīng)過外固定、EDTA脫礦后，進行常規(guī)包埋切片。切片脫蠟水化后，用DAPI染色液行細胞核染色并通過熒光顯微鏡直接觀察GFP+細胞在體內(nèi)的遷移與分化，利用圖像處理軟件檢測移植細胞的歸巢效率，評價高脂血癥對移植細胞歸巢的影響;免疫組化染色的方法檢測攜帶GFP的骨髓基質(zhì)干細胞在骨缺損區(qū)的分布及分化;組織切片經(jīng)蘇木素一

11、伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色、馬松三色(Masson's Trichrome，MT)染色后在光學顯微鏡下觀察骨缺損區(qū)組織學變化，并利用圖像分析軟件測量新骨形成面積以評價高脂血癥對骨再生的影響。
　　結果:
　　1.骨髓基質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和感染
　　利用全骨髓貼壁法可成功分離骨髓基質(zhì)干細胞，原代細胞的純度較低，經(jīng)過2～3次傳代之后可以獲得純化，細胞大小、形態(tài)穩(wěn)定。流式細胞儀檢測P

12、4代細胞表面標記發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)干細胞表達CD44(96.48％)，CD29(97.98％);而不表達CD31(0.71％)和CD45(5.72％)。成纖維細胞克隆形成單位實驗顯示骨髓基質(zhì)干細胞具有較強的克隆形成能力。小鼠骨髓基質(zhì)干細胞骨向誘導4周后進行茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)有致密紅染的細胞外基質(zhì)沉積和礦化結節(jié)的形成;脂向誘導2周后進行油紅O染色，可見大量紅色脂滴形成;成軟骨誘導3周后進行甲苯胺藍染色，觀察到細胞胞質(zhì)內(nèi)有異染藍色，以上結果提示本實

13、驗分離培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞具有多向分化的潛能。攜帶CFP基因的慢病毒感染骨髓基質(zhì)干細胞48小時后，熒光顯微鏡下可觀察到大部分細胞發(fā)出明亮的綠色熒光，96小時達到最強;感染后的細胞形態(tài)沒有明顯改變，生長狀態(tài)良好;經(jīng)過G418篩選獲得的GFP+骨髓基質(zhì)干細胞可大量擴增，GFP隨細胞傳代持久、穩(wěn)定表達。
　　2.高脂血癥模型的建立及小鼠骨髓基質(zhì)千細胞的移植
　　ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)4周時的血脂水平較C57BL/6J小鼠明

14、顯升高，其中血清總膽固醇水平升高了8.1倍，低密度脂蛋白水平升高了14.4倍，而高密度脂蛋白和甘油三酯的血清水平僅升高了2.3和1.7倍，說明高脂血癥動物模型成功建立;實驗期間兩種小鼠的體重持續(xù)增長，沒有明顯差異。免疫熒光顯微鏡直接觀察和免疫組化染色分析顯示，術后1周骨缺損部位GFP+細胞數(shù)量達到高峰，細胞形態(tài)表現(xiàn)為成纖維細胞樣;2周和4周時GFP+細胞的數(shù)量逐漸減少，在骨缺損邊緣和新骨形成區(qū)檢測到GFP+成骨細胞;通過對GFP+細胞數(shù)

15、進行計數(shù)統(tǒng)計并計算歸巢率，發(fā)現(xiàn)在相同的時間點高脂血癥小鼠的移植細胞歸巢率明顯低于C57BL/6J小鼠。HE、MT染色后的組織學觀察發(fā)現(xiàn)術后1周所有動物的骨缺損區(qū)均充滿纖維結締組織，沒有新骨形成;術后2周，骨缺損中央可見骨島形成;術后4周，可觀察到缺損區(qū)有大面積新骨形成。組織形態(tài)學分析顯示C57BL/6J小鼠比ApoE-/-小鼠表現(xiàn)出更強的新骨生成能力，而接受BMSCs移植的小鼠其新骨形成面積比未接受細胞移小鼠相對較多，比較各組的新骨形成

16、面積均具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。
　　結論:
　　1.全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞操作簡單，易于掌握;細胞經(jīng)過換液、2～3次傳代后獲得純化。分離培養(yǎng)獲得的小鼠骨髓基質(zhì)干細胞形態(tài)穩(wěn)定，具備干細胞特性:擁有較強的克隆形成能力并能誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。攜帶GFP基因的慢病毒能夠有效的感染骨髓基質(zhì)干細胞，感染后的骨髓基質(zhì)干細胞能夠持久穩(wěn)定表達GFP，并于體外大量擴增。
　　2.經(jīng)小鼠尾靜脈移植的骨