榛花消腎安膠囊干預(yù)實驗性糖尿病大鼠足細(xì)胞裂孔隔膜、足突與粘附分子的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是臨床上常見而嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，臨床特征為蛋白尿漏出，腎功能進(jìn)行性惡化，病理變化為腎小球濾過率改變，基底膜增厚，系膜細(xì)胞增寬，直至腎小球硬化，發(fā)展至腎功衰竭。其發(fā)病率隨著糖尿病患者數(shù)的增加，愈來愈高，嚴(yán)重威脅著人類的健康。DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜而多，近幾年來，很多研究表明，各種原因?qū)е略谀I小球濾過膜的足細(xì)胞損傷參與了DN產(chǎn)生發(fā)展中起很大的作用，因此對足細(xì)胞的研究而改

2、善足細(xì)胞功能的藥物成為治療DN的關(guān)注點。
　　導(dǎo)師南征教授認(rèn)為，“毒損腎絡(luò)，邪伏膜原”理論是DN的主要病因病機(jī)，提出了“解毒通絡(luò)，益腎導(dǎo)邪，疏利膜原”治療思路與方法。榛花消腎安膠囊是南征教授常用的治療DN的經(jīng)驗方，在臨床上療效顯著。通過本實驗觀察實驗性糖尿病大鼠的腎臟及足細(xì)胞相關(guān)蛋白CD2AP、podocin、α-actinin-4、podocalyxin、α3β1-integrin的表達(dá)影響，表明“榛花消腎安膠囊”治療DN的有效

3、性。
　　方法：
　　1.將wistar雄性大鼠70只適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常對照組（10只）和造模組（60只），造模組腹腔注射1％STZ（50mg/kg）以制備實驗性糖尿病大鼠模型，72小時后，尾靜脈采血，測空腹血糖≥16.7mmol/L者視為造模成功。將造模成功的51只大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組11只，榛花消腎安膠囊高、中、低劑量組，厄貝沙坦片組各10只。中藥高、中、低劑量組分別以1g/kg/d,0.5g/kg/d，

4、0.25g/kg/d，予榛花消腎安膠囊混懸液灌胃；西藥對照組予厄貝沙坦混懸液20mg/kg/d灌胃，連續(xù)灌胃觀察12周。觀察大鼠一般狀態(tài)，檢測空腹血糖、24h尿微量白蛋白、TC、TG，Scr、BUN等。
　　2.應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)及足細(xì)胞改變，觀察榛花消腎安膠囊對糖尿病大鼠腎臟病理結(jié)構(gòu)的影響。
　　3.采用免疫組化方法觀察足細(xì)胞裂孔隔膜CD2AP、podocin的蛋白表達(dá)；應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測C

5、D2AP、podocin m RNA表達(dá)。
　　4.采用免疫組化方法觀察足細(xì)胞足突及粘附分子α-actinin-4、podocalyxin的蛋白表達(dá)；應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)檢測α-actinin-4、podocalyxin、α3β1-integrin m RNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.正常對照組大鼠的精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，反應(yīng)靈敏，體重持續(xù)增加。DM模型組大鼠的精神狀態(tài)較差，毛發(fā)無光澤、豎起，活動緩慢，三多一少（

6、多飲、多食、多尿、消瘦）癥狀明顯，少部分大鼠身體的某些部位出現(xiàn)膿腫、潰爛，實驗期間死亡4只大鼠。中藥高、中、低劑量組和西藥對照組大鼠的精神狀態(tài)、活動反應(yīng)不如正常對照組大鼠，體重增加速度較慢，后期的尿量較前期減少，實驗期間中藥高、中、低劑量組各死亡2只大鼠，西藥對照組死亡2只大鼠。
　　2.腎臟組織光鏡觀察：DM模型組：大鼠的腎小球系膜區(qū)彌漫性增寬，MC輕度增生，部分毛細(xì)血管受壓而塌陷，GBM增厚，腎小球ECM增多，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸

7、潤，間質(zhì)纖維組織增生，腎小球囊粘連。中藥高、中、低劑量組及西藥對照組：腎小球結(jié)構(gòu)也有類似病理改變，但較DM模型組明顯減輕，大鼠腎小球ECM增多以及MC增生較DM模型組明顯減輕，大部分毛細(xì)血管腔呈開放狀態(tài)，間質(zhì)纖維組織的增生較DM模型組減少。中藥高、中、低劑量組、西藥對照組與DM模型組比較，腎組織損傷均明顯減輕（P<0.05）。電鏡觀察：DM模型組：大鼠腎小球濾過膜的改變明顯，GBM彌漫性增厚，內(nèi)皮細(xì)胞增生，內(nèi)皮細(xì)胞廣泛融合，足細(xì)胞的數(shù)目

8、減少，足細(xì)胞足突廣泛融合，系膜區(qū)擴(kuò)大，系膜基質(zhì)明顯增多。中藥高、中、低劑量組與西藥對照組：上述的病理改變均不同程度減輕，大鼠的腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞正常，足突部分融合，GBM未見增厚，系膜區(qū)未見明顯擴(kuò)大。
　　3.中藥高、中、低劑量組的體重和尿量均較 DM模型組有顯著性差異（P<0.01）；且中藥高、中、低劑量組間均有顯著差異（P<0.01）；中藥高劑量組的尿量改善情況明顯優(yōu)于西藥對照組（P<0.01）。在第4、8、12周檢測各組

9、大鼠的24h尿微量白蛋白的含量（ALB）。DM模型組、中藥各劑量組、西藥對照組大鼠的ALB含量逐漸增多，而且每個時期較正常對照組明顯升高（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組和西藥對照組，從第4周開始ALB的含量較DM模型組均明顯降低（P<0.01）；中藥高劑量組與西藥對照組比較，有顯著差異（P<0.05）。DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）水平均明顯高于正常對照組（P<0.01）；中藥

10、高、中、低劑量組及西藥對照組大鼠的BUN、Scr水平均明顯低于DM模型組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組間有顯著性差異（P<0.01）；中藥高劑量組與西藥對照組比較，無明顯差異（P>0.05）。
　　4. DM模型組，中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠血糖均明顯高于正常對照組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠血糖均明顯低于DM模型組（P<0.01）；中藥高、中劑量組空腹血糖較西藥對照組明顯降低（P<0.

11、01）；西藥對照組與中藥低劑量組無明顯差異（P>0.05）；中藥高劑量組與低劑量組間有顯著性差異（P<0.01）。
　　5.測定各組大鼠的膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量。DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠TC含量均明顯高于正常對照組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組TC含量較DM模型組均明顯減少（P<0.01）；西藥對照組與DM模型組間無明顯差異（P>0.05）；中藥高、中劑量組與低劑量組間有顯著性差異（P

12、<0.01）；中藥高、中劑量組與西藥對照組間有明顯差異（P<0.01）。DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的TG含量均高于正常對照組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠TG含量均明顯低于DM模型組（P<0.01）；中藥高、中劑量組與低劑量組間有顯著性差異（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組與西藥對照組間有顯著性差異（P<0.01）。
　　6.應(yīng)用免疫組化法以及實時定量PCR檢測各組大鼠腎組織中CD

13、2AP表達(dá)。光鏡下所見：正常對照組的CD2AP在腎小球中沿著毛細(xì)血管祥呈線樣分布均勻，而在足細(xì)胞的胞質(zhì)側(cè)表達(dá)，表達(dá)較強(qiáng)；DM模型組的CD2AP表達(dá)明顯較少，部分區(qū)域節(jié)段性缺少；中藥高、中、低劑量組和西藥對照組CD2AP表達(dá)較DM模型組明顯改善?；叶戎禉z測結(jié)果：DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的CD2AP灰度值均低于正常對照組（P<0.01）。中藥高、中、低劑量組和西藥對照組大鼠灰度值均高于 DM模型組（P<0.01）。中

14、藥高劑量組與中藥低劑量組間有顯著差異（P<0.01）；中藥高劑量組與西藥對照組間無明顯差異（P>0.05）。DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的CD2AP m RNA含量均明顯低于正常對照組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組和西藥對照組大鼠的CD2AP m RNA含量均明顯高于DM模型組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組間有顯著差異（P<0.01）；中藥高劑量組與西藥對照組間無明顯差異（P>0.05）。
　　

15、7.應(yīng)用免疫組化法以及實時定量PCR檢測各組大鼠腎組織中podocin表達(dá)。光鏡下所見：正常對照組的podocin，在腎小球中沿著 GBM呈線狀分布均勻；DM模型組的podocin表達(dá)明顯減少；中藥高、中、低劑量組、西藥對照組的podocin表達(dá)較 DM模型組均明顯改善?；叶戎禉z測結(jié)果：DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的podocin灰度值均低于正常對照組（P<0.01）。中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的灰度值均高

16、于 DM模型組（P<0.01）。中藥高劑量組與低劑量組間有明顯差異（P<0.01）；中藥高劑量組與西藥對照組間無明顯差異（P>0.05）。實時定量PCR結(jié)果：DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的podocin m RNA含量均明顯低于正常對照組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的podocin m RNA含量均明顯高于DM模型組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組間有顯著差異（P<0.01）；榛花消腎

17、安膠囊高劑量組與西藥對照組間無明顯差異（P>0.05）。
　　8.應(yīng)用免疫組化法以及實時定量PCR檢測各組大鼠腎組織中α-actinin-4的表達(dá)。光鏡下所見：正常對照組的α-actinin-4蛋白沿著腎小球基底膜毛細(xì)血管樣點線狀分布均勻；DM模型組的α-actinin-4蛋白表達(dá)明顯高于正常對照組；中藥高、中、低劑量組和西藥對照組的α-actinin-4蛋白表達(dá)較DM模型組減弱。灰度值檢測結(jié)果：DM模型組、中藥高、中、低劑量組、

18、西藥對照組大鼠α-actinin-4灰度值均高于正常對照組（P<0.01）。中藥高、中、低劑量組和西藥對照組大鼠灰度值均低于DM模型組（P<0.01）。中藥高劑量組與中藥中、低劑量組間有顯著差異（P<0.01）；中藥高劑量組與西藥對照組間有顯著差異（P<0.05）。DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的α-actinin-4 m RNA含量均明顯高于正常對照組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組和西藥對照組α-actini

19、n-4 m RNA含量均低于DM模型組（P<0.01）；中藥高劑量組與西藥對照組間無明顯差異（P>0.05）；中藥高、中、低劑量組間有顯著性差異（P<0.01）。
　　9.應(yīng)用免疫組化法以及實時定量PCR檢測各組大鼠腎組織中podocalyxin的表達(dá)。光鏡下所見：正常對照組腎小球內(nèi)podocalyxin在腎小球中沿著GBM呈線狀分布均勻。DM模型組腎小球內(nèi) podocalyxin蛋白表達(dá)節(jié)段性缺少。中藥高、中、低劑量組、西藥對照

20、組表達(dá)輕微缺失，但較DM模型組增加?；叶戎禉z測結(jié)果：DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠podocalyxin灰度值均低于正常對照組（P<0.01）。中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠灰度值均高于 DM模型組（P<0.01）。中藥高劑量組與中藥中、低劑量組間有顯著差異（P<0.01）；中藥高劑量組與西藥對照組間有顯著差異（P<0.05）。
　　10.應(yīng)用實時定量PCR檢測各組大鼠腎組織中α3β1整合素的表達(dá)。DM模型

21、組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠α3β1整合素 m RNA含量均明顯低于正常對照組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組、西藥對照組α3β1整合素 m RNA含量均高于DM模型組（P<0.01）；中藥高、中、低劑量組間有顯著性差異（P<0.01）；中藥高劑量組與西藥對照組間無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：本實驗研究結(jié)果說明，榛花消腎安膠囊能夠改善實驗性DM大鼠一般狀態(tài)；減輕腎組織病理結(jié)構(gòu)，減少尿微量白蛋白的排出；改

22、善糖脂代謝。同時，能夠改善足細(xì)胞相關(guān)蛋白CD2AP、podocin、podocalyxin的表達(dá)，抑制α-actinin-4蛋白的表達(dá)，從而減輕腎組織的損害，改善腎功能，延緩DM發(fā)展。
　　導(dǎo)師南征教授認(rèn)為，DN的病機(jī)關(guān)鍵是“毒損腎絡(luò)，邪伏膜原”。本實驗根據(jù)病機(jī)關(guān)鍵，應(yīng)用“解毒通絡(luò)、益腎導(dǎo)邪、疏利膜原”理論與西醫(yī)學(xué)DN的發(fā)病機(jī)制，腎小球濾過膜和足細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其功能聯(lián)系在一起。榛花消腎安膠囊在解毒通絡(luò)、益腎導(dǎo)邪、疏利膜原的治療大法下，