GP73基因轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗的制備及對(duì)肝癌免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、GP73-DNA瘤苗的構(gòu)建及表達(dá)研究
　　目的:構(gòu)建GP73-cDNA慢病毒表達(dá)載體，并體外感染樹(shù)突狀細(xì)胞(DC2.4)，制備GP73-DC疫苗，同時(shí)用攜帶GP73基因的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠Hepa1-6肝癌細(xì)胞為進(jìn)一步研究該疫苗的免疫治療作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:將人GP73基因克隆到慢病毒GV358載體，通過(guò)PCR和測(cè)序鑒定獲得連接正確的克隆。將鑒定后的重組表達(dá)質(zhì)粒GV358-GP73與pHelpe r1.0質(zhì)粒和p

2、Helper2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備攜帶GP73基因的慢病毒LentivirusGP73。應(yīng)用LentivirusGP73感染體外培養(yǎng)的DC2.4細(xì)胞和Hepa1-6肝癌細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)感染后的DC2.4細(xì)胞和Hepa1-6細(xì)胞中GP73蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:構(gòu)建的慢病毒載體GV358-GP73經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序正確，包裝慢病毒LentivirusGP73滴度為2×108TU/mL。慢病毒Lentivi

3、rus-GP73感染DC2.4細(xì)胞和Hepa1-6細(xì)胞后GP73表達(dá)明顯增加。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了攜帶人GP73基因的慢病毒表達(dá)載體，慢病毒Lent ivirusGP73能高效感染DC2.4細(xì)胞和Hepa1-6細(xì)胞，并且成功表達(dá)GP73蛋白。
　　第二部分、GP73-DNA瘤苗誘導(dǎo)CTL特異性殺傷肝癌細(xì)胞的研究
　　目的:GP73-DC2.4細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，觀察其對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　

4、方法:從小鼠的脾臟中提取T淋巴細(xì)胞，分三組與DC2.4細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞，分別為GP73-DC2.4組，陰性病毒-DC2.4組，未轉(zhuǎn)染DC2.4組;將每組誘導(dǎo)產(chǎn)生CTLs和未經(jīng)誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞分別與轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的Hepa1-6細(xì)胞共培養(yǎng)。CCK8法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)，CytoTox96(R)非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)法檢測(cè)CTLs細(xì)胞對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　結(jié)果:成功誘導(dǎo)了T淋巴細(xì)胞的增殖，增殖率為67

5、％。GP73-DC2.4疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTLs對(duì)Hepa1-6細(xì)胞具有殺傷作用，GP73-DC2.4組對(duì)GP73-Hepa1-6細(xì)胞的殺傷效應(yīng)明顯高于未轉(zhuǎn)染的Hepa1-6組、陰性對(duì)照病毒負(fù)載組及未處理DC2.4組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:以GP73-DC2.4疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTLs細(xì)胞對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6細(xì)胞具有更顯著的殺傷效應(yīng)。
　　第三部分、GP73-DNA瘤苗體內(nèi)抗腫瘤研究
　　目的:建立C57B

6、L/6J小鼠肝癌成瘤模型，觀察GP73-DC2.4疫苗對(duì)成瘤小鼠體內(nèi)免疫治療HCC的作用。
　　方法:40只C57BL/6J小鼠右腋皮下接種小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6，建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，隨機(jī)分成4組，每組10只，雌雄各半。分別為PBS組，GP73-DC2.4組，陰性病毒-DC2.4組，未轉(zhuǎn)染DC2.4組。于造模后腫瘤大小長(zhǎng)至20mm后，第0天開(kāi)始，以后每7天給予DC疫苗瘤內(nèi)注射，每?jī)商旆Q(chēng)量體重一次。第21天處死小鼠取出

7、瘤組織。瘤組織測(cè)量大小并計(jì)算抑瘤率;
　　結(jié)果:在給小鼠接種Hepa1-6細(xì)胞第6天后開(kāi)始生長(zhǎng)，在第12天的時(shí)候長(zhǎng)至20mm，注射疫苗后第7天開(kāi)始出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤大小明顯變小;GP73-DC2.4組抑瘤率為65.03％，陰性病毒-DC2.4組抑瘤率為55.42％，未轉(zhuǎn)染DC2.4組抑瘤率為40.37％，與PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　結(jié)論:成功構(gòu)建小鼠肝癌成瘤模型，GP73-DC2.4疫苗對(duì)HCC的體內(nèi)免