GP73基因轉染樹突狀細胞瘤苗的制備及對肝癌免疫治療的實驗研究.pdf

1、第一部分、GP73-DNA瘤苗的構建及表達研究
　　目的:構建GP73-cDNA慢病毒表達載體，并體外感染樹突狀細胞(DC2.4)，制備GP73-DC疫苗，同時用攜帶GP73基因的慢病毒轉染小鼠Hepa1-6肝癌細胞為進一步研究該疫苗的免疫治療作用奠定基礎。
　　方法:將人GP73基因克隆到慢病毒GV358載體，通過PCR和測序鑒定獲得連接正確的克隆。將鑒定后的重組表達質粒GV358-GP73與pHelpe r1.0質粒和p

2、Helper2.0質粒共轉染293T細胞，制備攜帶GP73基因的慢病毒LentivirusGP73。應用LentivirusGP73感染體外培養(yǎng)的DC2.4細胞和Hepa1-6肝癌細胞，Western Blot檢測感染后的DC2.4細胞和Hepa1-6細胞中GP73蛋白表達。
　　結果:構建的慢病毒載體GV358-GP73經PCR鑒定和測序正確，包裝慢病毒LentivirusGP73滴度為2×108TU/mL。慢病毒Lentivi

3、rus-GP73感染DC2.4細胞和Hepa1-6細胞后GP73表達明顯增加。
　　結論:成功構建了攜帶人GP73基因的慢病毒表達載體，慢病毒Lent ivirusGP73能高效感染DC2.4細胞和Hepa1-6細胞，并且成功表達GP73蛋白。
　　第二部分、GP73-DNA瘤苗誘導CTL特異性殺傷肝癌細胞的研究
　　目的:GP73-DC2.4細胞誘導培養(yǎng)淋巴細胞，觀察其對Hepa1-6肝癌細胞的殺傷效應。
　　

4、方法:從小鼠的脾臟中提取T淋巴細胞，分三組與DC2.4細胞進行共培養(yǎng)誘導T淋巴細胞，分別為GP73-DC2.4組，陰性病毒-DC2.4組，未轉染DC2.4組;將每組誘導產生CTLs和未經誘導的T淋巴細胞分別與轉染和未轉染的Hepa1-6細胞共培養(yǎng)。CCK8法檢測T淋巴細胞的增殖效應，CytoTox96(R)非放射性細胞毒性檢測法檢測CTLs細胞對Hepa1-6肝癌細胞的殺傷效應。
　　結果:成功誘導了T淋巴細胞的增殖，增殖率為67

5、％。GP73-DC2.4疫苗誘導產生的CTLs對Hepa1-6細胞具有殺傷作用，GP73-DC2.4組對GP73-Hepa1-6細胞的殺傷效應明顯高于未轉染的Hepa1-6組、陰性對照病毒負載組及未處理DC2.4組(P＜0.05)。
　　結論:以GP73-DC2.4疫苗誘導產生的CTLs細胞對小鼠肝癌細胞系Hepa1-6細胞具有更顯著的殺傷效應。
　　第三部分、GP73-DNA瘤苗體內抗腫瘤研究
　　目的:建立C57B

6、L/6J小鼠肝癌成瘤模型，觀察GP73-DC2.4疫苗對成瘤小鼠體內免疫治療HCC的作用。
　　方法:40只C57BL/6J小鼠右腋皮下接種小鼠肝癌細胞系Hepa1-6，建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，隨機分成4組，每組10只，雌雄各半。分別為PBS組，GP73-DC2.4組，陰性病毒-DC2.4組，未轉染DC2.4組。于造模后腫瘤大小長至20mm后，第0天開始，以后每7天給予DC疫苗瘤內注射，每兩天稱量體重一次。第21天處死小鼠取出

7、瘤組織。瘤組織測量大小并計算抑瘤率;
　　結果:在給小鼠接種Hepa1-6細胞第6天后開始生長，在第12天的時候長至20mm，注射疫苗后第7天開始出現實驗組腫瘤大小明顯變小;GP73-DC2.4組抑瘤率為65.03％，陰性病毒-DC2.4組抑瘤率為55.42％，未轉染DC2.4組抑瘤率為40.37％，與PBS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　結論:成功構建小鼠肝癌成瘤模型，GP73-DC2.4疫苗對HCC的體內免