樹突狀細(xì)胞瘤苗聯(lián)合吉西他濱對肝癌干細(xì)胞的殺傷效應(yīng).pdf

1、研究目的
　　原發(fā)性肝癌是肝臟最常見的惡性腫瘤，同時也是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。原發(fā)性肝癌嚴(yán)重威脅著人類的健康，其病因和發(fā)病機制尚不完全明確，目前已知的主要致病因素有乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、黃曲霉毒素B1的食入、酗酒、非酒精性肝臟疾病以及遺傳性疾病等。在諸多致病因素中最重要為乙型肝炎病毒感染。目前我國大約有9300萬乙型肝炎病毒攜帶者，其中約2千萬為慢性肝炎患者。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤可能是一種干細(xì)胞性疾病，多種腫

2、瘤中包含有腫瘤干細(xì)胞，其中包括肝癌。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤起始、腫瘤細(xì)胞自我更新和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。對于肝癌的治療來說，復(fù)發(fā)是導(dǎo)致治療結(jié)果不滿意的主要原因。手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)可能是由于殘留的腫瘤干細(xì)胞在一定條件下重新啟動腫瘤生長所致，所以針對肝癌干細(xì)胞的治療有可能阻止肝癌的復(fù)發(fā)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)等科研技術(shù)水平的不斷提高，生物免疫療法應(yīng)用于惡性腫瘤越來越受到關(guān)注。樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫治療已是目前研究中的一個熱點，并在基礎(chǔ)

3、研究和臨床試驗中都已經(jīng)取得了積極的進(jìn)展。CD133分子是肝癌干細(xì)胞的重要細(xì)胞分子標(biāo)記物，本實驗將從人肝癌細(xì)胞系Huh-7中分選出CD133+細(xì)胞，然后探討負(fù)載CD133+肝癌細(xì)胞抗原的樹突狀細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)的免疫治療聯(lián)合吉西他濱(GEM)在體外對肝癌干細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　研究方法
　　選取常見的人肝癌細(xì)胞系Huh-7，將其擴增至一定數(shù)量，在培養(yǎng)至對數(shù)生長期時以CD133作為分子標(biāo)志進(jìn)行流式細(xì)胞分選，獲得CD133+的肝癌細(xì)

4、胞即肝癌干細(xì)胞。取健康成年人外周血進(jìn)行血細(xì)胞分離，將獲得的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)在體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化為樹突狀細(xì)胞(DC)，隨后負(fù)載Huh-7細(xì)胞和CD133+細(xì)胞抗原，負(fù)載抗原前后分別利用流式細(xì)胞術(shù)分析其表面分子CD80、CD83和CD86的表達(dá)情況。DC負(fù)載Huh-7細(xì)胞和CD133+細(xì)胞抗原后與T細(xì)胞共育得到特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，將CD133+細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性實驗。實驗組按處理因素分為:1.GEM組;2.CD133+

5、-CTL組;3.GEM+CD133+-CTL組;4.Huh7-CTL組;5.GEM+Huh7-CTL組。CCK-8法檢測殺傷率，然后比較各組間差異。
　　結(jié)果
　　1.Huh-7細(xì)胞呈貼壁型生長，生長狀態(tài)良好，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選出CD133+細(xì)胞，此類細(xì)胞約占細(xì)胞群的（3.0±0.78）％，分選效率為分選效率在90％-99％。
　　2.培養(yǎng)第1天的DCs均貼壁生長，胞體較小;第3天DCs貼壁疏松;第5天DCs呈聚集生長的

6、趨勢;第8天時細(xì)胞大部分懸浮或半懸浮生長，細(xì)胞突起增多。流式細(xì)胞分析顯示DC負(fù)載抗原后表面分子標(biāo)志明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.對CD133+細(xì)胞的殺傷效應(yīng)以GEM+CD133+-CTL組最強，與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而單獨就DC瘤苗殺傷率而言，CD133+-CTL組要高于Huh7-CTL組(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　本實驗研究證明了CD133+肝癌干細(xì)胞存在于肝癌細(xì)胞系Huh-