IL-2基因轉(zhuǎn)染的CIK細(xì)胞聯(lián)合樹突狀細(xì)胞的抗肝癌實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分： 目的：克隆人白細(xì)胞介素2基因(IL-2)，構(gòu)建重組pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒載體。 方法：從PHA體外刺激培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞中提取mRNA，設(shè)計(jì)特異性引物，以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法制備互補(bǔ)DNA(cDNA)模板，以PCR方法擴(kuò)增IL-2基因，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后克隆至測序載體pGEM-T-Easy，挑取陽性克隆經(jīng)鑒定后測序，將測序正確的IL-2基因片段

2、用Bgl Ⅱ和PmeI雙酶切消化回收并純化后定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒載體中。酶切鑒定后通過磷酸鈣共沉淀法將線性化重組質(zhì)粒和腺病毒骨架共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，擴(kuò)增純化重組腺病毒，并使用TCID50法測定AdBM5-GFP-IL-2重組腺病毒滴度。 結(jié)論：成功構(gòu)建了含IL-2基因的重組腺病毒表達(dá)載體(pAdBM5-GFP-IL-2)，為下一步擴(kuò)增重組腺病毒開展肝癌的免疫與基因治療研究奠定基礎(chǔ)。 第二部分

3、： 目的：探討IL-2基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)聯(lián)合樹突狀細(xì)胞(DC)對肝癌細(xì)胞的殺傷作用。 方法：采用密度梯度離心法從健康人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞(PMBC)，分別誘導(dǎo)CIK細(xì)胞(培養(yǎng)體系：將分離得到的PMBC置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞，采用抗CD3單克隆抗體50ng/ml、rhIL-21000U/ml、rhIL-1 1000U/ml和IFN-Y 1000U/ml聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞)和DC(

4、培養(yǎng)體系：貼壁細(xì)胞經(jīng)rhIL-4 100ng/ml和rhGM-CSF 100ng/ml誘導(dǎo)培養(yǎng)DC)。用攜帶IL-2基因的重組腺病毒AdBM5-GFP-IL-2轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞(MOI=100)，用HepG2肝癌凍融抗原沖擊致敏DC(DC與肝癌抗原的比例為1：20)，然后將轉(zhuǎn)染IL-2基因的CIK細(xì)胞(CIKpIL-2)與肝癌抗原致敏DC(DC-Ag)共培養(yǎng)，制備肝癌抗原致敏DC激活的IL-2基因修飾的CIK細(xì)胞(DC-Ag-CIKpIL