HBsAg基因修飾DC瘤苗不同免疫途徑對肝癌治療的實驗研究.pdf

1、肝癌為我國常見惡性腫瘤之一，我國每年約有l(wèi)l萬人死于肝癌，且發(fā)病率有上升趨勢。肝癌患者的生存時間一般低于6個月，目前臨床較為有效的治療方法有手術切除、肝移植、栓塞化療、無水酒精注射、低溫消融等，這些治療措施僅對小肝癌有較好的治療效果，對遠處轉移的微小病灶其療效尚不能令人滿意。近年來，腫瘤的免疫治療成為腫瘤研究的新熱點。由于腫瘤患者機體免疫功能存在嚴重障礙，特別是樹突狀細胞(DC)存在數量和功能上的缺陷，無法誘導初次免疫應答和激活特異性細

2、胞毒性T淋巴細胞(CTL)效應，使機體無法對腫瘤抗原產生再次免疫應答。為了增強機體的免疫應答，有研究者將腫瘤患者自身的DC進行體外培養(yǎng)，并將腫瘤抗原導入DC，結果發(fā)現(xiàn)這種方法可以激發(fā)機體對腫瘤細胞的免疫應答，此即為以DC為基礎的腫瘤疫苗(簡稱DC瘤苗)。 近年來，DC瘤苗在實驗性肝癌免疫治療中取得了良好效果，Lee等應用肝癌細胞株Hepa1-6裂解物致敏的DC治療實驗性小鼠肝癌，結果58.3％的小鼠腫瘤消失，對于大的肝癌也能使腫

3、瘤縮小。然而目前的DC瘤苗在肝癌治療方面存在諸多不足：(1)肝癌細胞的抗原性較弱，缺乏特異性抗原。研究發(fā)現(xiàn)只有使用典型腫瘤抗原多肽的抗原決定簇致敏DC才能誘導出抗腫瘤反應，目前可以確定的腫瘤特異性抗原與腫瘤相關抗原有限，單一抗原的免疫攻擊尚不足以有效地殺滅體內的腫瘤細胞，迄今人們尚未找到肝癌特異性抗原，因此，對于肝癌的免疫治療首要問題是尋找和選擇理想的肝癌特異性抗原或相關抗原；(2)DC瘤茁在誘導抗腫瘤效應的同時也誘發(fā)了嚴重的自身免疫性

4、疾病。有研究發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白(AFP)可作為腫瘤相關抗原應用于肝癌免疫治療，然而針對AFP的細胞免疫并不能有效治療HBV相關性肝癌。在我國，肝癌的發(fā)生與HBV感染密切相關，相關研究已經發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清HBsAg檢出率高達90％以上，提示HBsAg是肝癌的重要相關抗原之一。以HBsAg作為肝癌相關抗原構建DC瘤苗進行免疫治療可能是一個合理的選擇。目前HBsAg—DC瘤苗對肝癌的免疫治療作用研究不多，有關HBV抗原基因修飾DC瘤苗不同途徑對肝癌

5、的免疫治療更未見報道。鑒此，本研究以整合HBV基因組的HepG222.1.5為細胞模型，通過攜帶有編碼HBsAg基因的重組腺病毒載體的介導，探討不同免疫途徑腺病毒介導的HBs抗原基因修飾的DC瘤苗對肝癌動物模型的免疫治療效果，以期為HBV抗原基因修飾DC瘤苗治療肝癌提供實驗依據。 材料與方法： 1.小鼠DC的誘導培養(yǎng)和鑒定[43]：參考Inaba等技術并稍作改進，采集小鼠骨髓細胞，通過在細胞因子GM—CSF、IL-4和T

6、NF—a刺激下，誘導培養(yǎng)出成熟的Dc細胞；采用流式細胞儀分析DC特異性表面分子的表達；采用MTT法進行同種異體的混合淋巴細胞反應試驗(MLR)； 2.HBsAg基因修飾的DC(HBsAg—DC)瘤苗構建[39]：采用重組腺病毒介導HBsAg基因修飾樹突狀細胞，構建攜帶HBsAg基因的DC瘤苗； 3.肝癌動物模型的建立[68]：取對數生長期的HepG222.1.5肝癌細胞接種于C57BL/6J小鼠腿部皮下，建立荷瘤小鼠模型

7、； 4.HBsAg—DC瘤苗對實驗性肝癌的治療：采用皮下注射、靜脈注射和瘤體注射三種途徑回輸HBsAg—DC瘤苗，比較不同治療途徑HBsAg—DC瘤苗對荷瘤C57BL/6J小鼠免疫治療作用； 5.HBsAg—DC瘤苗對實驗性肝癌的免疫保護性作用：選擇研究(4)所得的最佳免疫治療途徑，給予C57BL/6J小鼠注射HBsAg—DC瘤苗2次，后接種對數生長期的HepG222.1.5肝癌細胞(未轉染DC瘤苗和PBS做對照)，用乳

8、酸脫氫酶釋放法測定免疫小鼠脾特異性CTL殺傷活性，探討HBsAg—DC瘤苗保護性免疫反應。 統(tǒng)計學處理 使用spss12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均值士標準差((-x)±s)表示，資料采用方差統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果 1.DC的培養(yǎng)及鑒定 1.1在倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)初可見有較多粘附圓形細胞，隨著時間推移，胞體出現(xiàn)樹突狀突起，繼而呈集落樣生長，成熟后Dc細胞體

9、積明顯增大且形態(tài)不規(guī)則，有多個不等的突起，呈現(xiàn)特征性的星狀、樹突狀樹突樣的突起。培養(yǎng)過程所見符合DC形態(tài)學改變。 1.2采用免疫熒光對培養(yǎng)12d后所獲的DC細胞進行標記，通過流式細胞儀分析，結果表明，貼壁的DC前體細胞，在體外經過細胞因子誘導后，高表達CD40(81.4％)、CD80(63.5％)、CD86(72.6％)、33D1(61.7％)，具有典型的DC細胞表型標志。 1.3為了觀察DC刺激同種異體T細胞的增殖能力

10、，我們采用MTT法進行同種異體的混合淋巴細胞反應試驗(MLR)，結果顯示，在DC：T比例為1：1、1：5、1：10、1：20時，DC組刺激指數(SI)分別為：11.2、7.7、6.2、5.1，對照組(MNC)刺激指數(SI)分別為：3.3、2.6、1.8、1.2， (P<0.05)，DC具有很強的刺激同種異體T細胞的增殖能力。 2.HBsAg基因修飾DC瘤苗(HBsAg—DC)的構建 重組腺病毒載體轉染小鼠DC，通過倒置

11、熒光顯微鏡下觀察顯示，Ad—HBsAg轉染DC后48h，約90％以上DC表達示蹤的綠色熒光蛋白(EGFP)。用ELISA檢測轉染DC中目的蛋白HBsAg的分泌，結果于感染后1～4天可檢測出高水平的HBsAg并逐日增強，表明重組腺病毒已經有效介導HBsAg在DC中表達，成功構建出HBsAg—DC瘤苗。 3.HBsAg—DC瘤苗回輸途徑比較及對荷瘤小鼠的治療效果 分別通過皮下、尾靜脈、瘤體內注射HBsAg—DC瘤苗對荷瘤小鼠

12、模型治療，36天之內腫瘤大小變化分別為：(49.00±11.42)mm2、(61.08±6.56)mm2、(65.25±18.29)mm2，經方差統(tǒng)計分析，皮下、尾靜脈、瘤體內注射三組之間比較有明顯差異(F=3.4675，P<0.05)，皮下注射HBsAg—DE瘤苗明顯優(yōu)于瘤體內注射、尾靜脈注射(P<0.05)。瘤體內注射組與尾靜脈注射組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示最佳免疫治療途徑為皮下注射途徑。 4.HBsAg—D

13、C瘤苗皮下免疫治療效果分析 采用皮下免疫治療，HBsAg-DE組、未轉染DC組、PBS組三組之間36天內腫瘤大小變化分別為：(49.00±11.42)mm2、(82.83±22.48)mm2、(108.83±31.64)mm2，經方差統(tǒng)計分析，HBsAg-DC組、未轉染DC組、PBS組三組之間比較有明顯差異(F=19.7944，P<0.01)，HBsAg-DE瘤苗組腫瘤的生長明顯緩慢，未轉染DC組次之，PBS組腫瘤的生長速度最快

14、(P<0.05)，提示采用皮下注射HBsAg—DC瘤苗對實驗性肝癌有一定的免疫治療作用。 5.HBsAg-DC瘤苗免疫接種后對HepG222.1.5細胞攻擊的免疫保護作用 HBsAg—DC瘤苗免疫接種后，小鼠腫瘤的生長受到明顯抑制，瘤體出現(xiàn)延遲，同時生長減慢。接種后18 d時仍未長出腫瘤，而未轉染DC、PBS對照組小鼠均于接種后7d內成瘤，HBsAg-DE組、未轉染DC組、PBS組三組間36天內腫瘤大小變化分別為：(16

15、.17±6.94)mm2、(62.50±17.40)mm2、(108.83±31.64)mm2，經方差統(tǒng)計分析，HBsAg—DC組、未轉染DC組、PBS組三組之間比較有明顯差異(F=57.1539，P<0.01)，HBsAg-DE組優(yōu)于未轉染DC組和PBS組(P<0.05)，未轉染DC組優(yōu)于PBS組(P

16、L活性檢測結果 HBsAg—DC瘤苗免疫接種后誘導的脾臟來源CTL對靶細胞HepGz22.1.5具有明顯的殺傷活性。統(tǒng)計分析顯示，Ad—HBs轉染DC組對HepG222.1.5細胞的殺傷率(44.67％±10.68％)，明顯高于未轉染DC組和PBS組(11.6796±4.06％和5.67％±1.76％)(F=4.4508，P<0.05)，提示HBsAg—DE瘤苗對肝癌細胞有一定的免疫保護作用是通過誘導脾細胞CTL來實現(xiàn)的。

17、 結論： 1.通過誘導培養(yǎng)小鼠骨髓來源的DC，具有很強的刺激同種異體T細胞的增殖能力。成功培養(yǎng)誘導出具有活性的DC。 2.采用重組腺病毒轉染DC，成功構建}IBsAg基因修飾的DC瘤苗。 3.小鼠皮下注射HBsAg—DC瘤苗對肝癌的免疫治療作用明顯優(yōu)于瘤體內注射和尾靜脈注射，提示皮下注射HBsAg—DC瘤苗可能是最佳的免疫途徑。 4.HBsAg—DC瘤苗對肝癌荷瘤小鼠產生有較明顯的免疫治療作用，同時能夠