腺病毒介導的基因修飾樹突狀細胞肝癌瘤苗的制備及其抗HBV相關肝癌的免疫實驗的研究.pdf

1、目前DC在抗腫瘤免疫治療方面的研究已經(jīng)取得一些進展，并且在腫瘤的臨床治療上已顯示其良好的治療效果。但是由于大多數(shù)腫瘤來說，腫瘤組織中僅部分腫瘤細胞表達一種腫瘤相關抗原，針對單一腫瘤相關抗原的免疫應答無法清除所有腫瘤細胞。并且腫瘤細胞本身存在多種腫瘤相關抗原，針對單一抗原的免疫治療有時并不能發(fā)揮其應有的作用，激發(fā)的免疫效應弱。故近來為使DC能夠負載更多腫瘤抗原，發(fā)揮更大免疫治療效應，人們研究了DC負載多種抗原的制備方法，包括：經(jīng)照射的腫瘤

2、細胞與DC共培養(yǎng)，腫瘤細胞來源的RNA轉(zhuǎn)染DC，腺病毒介導多種腫瘤相關抗原感染DC以及多種腫瘤相關抗原肽沖擊致敏DC等方法。在這些方法中以腫瘤細胞來源的RNA轉(zhuǎn)染DC以及腺病毒介導多種腫瘤相關抗原感染DC最為有效，但腫瘤細胞來源的RNA具有生物活性不穩(wěn)定等缺點。因此，在本研究中，我們根據(jù)中國人原發(fā)性肝癌獨有的流行病學特點，應用HBV相關性肝癌中HBV病毒特異性抗原，聯(lián)合肝癌相關抗原AFP作為免疫治療靶點，制備AFP、HBsAg基因的腺病

3、毒載體，體外轉(zhuǎn)染人樹突狀細胞，比較HBsAg- DC 、AFP-DC以及AFP / HBsAg-DC瘤苗體外對HBsAg表達的人肝癌細胞株的殺傷活性。探討腺病毒介導的HBsAg、AFP基因共感染較單基因感染DC能否增強其體外誘導的特異性抗腫瘤免疫效應，以期選擇更為有效的DC肝癌瘤苗，為原發(fā)性HBV感染肝癌的治療尋求新的途徑。 第一部分：HBsAg、AFP基因重組腺病毒表達載體的構建及鑒定 目的:構建能高效轉(zhuǎn)導HBsAg

4、、AFP基因的重組腺病毒，進行病毒擴增和滴度測定，并檢測HBsAg、AFP抗原表達，以用于DC基因治療的實驗研究。 方法:應用Adeno-XTM腺病毒表達載體系統(tǒng)分別構建表達AFP、HBsAg的重組腺病毒和對照載體Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle形成穿梭載體，用PI-Sce Ⅰ和I-CeuⅠ雙酶切后將所獲HBsAg、AFP基因片段再與線性化的腺病毒載體Adeno-X連接,形成重組腺病毒質(zhì)粒，再以PacⅠ酶切線性化

5、，轉(zhuǎn)染HEK293細胞包裝為重組腺病毒。檢測病毒滴度后，進一步對重組腺病毒分別感染HEK293和H1299細胞的結果進行IFA法檢測目的基因在靶細胞中的有效表達。 結果:經(jīng)酶切、PCR鑒定證實，穿梭質(zhì)粒和重組腺病毒質(zhì)粒插入片段為HBsAg、AFP基因。包裝的腺病毒載體具有良好的感染性，可以在293細胞中形成病毒顆粒。滴度測定結果為Ad-S 2.65×109 PFU/ml；Ad-AFP采用同樣方法測定的滴度為3.16×109 P

6、FU/ml。重組腺病毒感染H1299細胞后IFA法檢測結果顯示目的基因表達于感染細胞中，表明腺病毒介導的HBsAg、AFP基因感染的有效性。 結論:成功構建了復制缺陷型AFP、HBsAg重組腺病毒及對照重組腺病毒Ad-GFP；重組腺病毒Ad-S、Ad-AFP能高效介導基因在被感染細胞內(nèi)有效表達。 第二部分：樹突狀細胞的體外誘導及其體外感染腺病毒效率的測定 目的:以經(jīng)動員富集的肝癌患者外周血單個核細胞（Mono

7、nuclear cell，MNC）為來源，建立體外誘導培養(yǎng)DC的方法；以健康供者MNC為對照，檢測肝癌DC的形態(tài)、表型及功能；利用Ad-GFP作為研究對象，測定腺病毒介導的樹突狀細胞的體外轉(zhuǎn)染效率。 方法:選擇肝癌患者及正常人外周血，血細胞分離機分離富集外周血MNC，經(jīng)淋巴細胞分離液梯度離心、聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板貼壁純化后，加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培養(yǎng)液聯(lián)合誘導DC分化，誘導d6加入TNF-α促進DC成熟

8、。分別以倒置顯微鏡、電子顯微鏡觀察DC形態(tài)變化，F(xiàn)CM檢測細胞表型變化。利用Ad-GFP作為研究對象，測定腺病毒介導的樹突狀細胞的體外轉(zhuǎn)染效率，MTT法檢測DC刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力。取培養(yǎng)第7天的DC，按不同的MOI將重組腺病毒加入培養(yǎng)孔中，F(xiàn)CM檢測細胞感染前后的表型變化以及腺病毒的感染效率。 結果:肝癌患者DC鑒定：誘導后，患者DC顯示出典型的形態(tài)及表型特征。誘導d8(加TNF-α活化48h)，各抗原表達量明顯升

9、高，分別為：CD1a( 71.45士4.39)％、CD11c( 89.68士3.16)％、CD86(91.17士4.43)％、CD80 ( 91.37士4.12)％、HLA-DR( 94.03士3.01 )％，為典型DC表型；健康對照DC各抗原表達量為CD1a( 68.45士5.02)％、CD11c( 91.09士2.01)％、CD86(92.19士4.36)％、CD80 ( 90.81士3.15)％、HLA-DR( 93.49士4.1

10、8 )％，二者間無顯著性差異(P>0.05 )?；旌狭馨图毎磻Y果顯示，患者DC具有高效地刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力，其刺激指數(shù)( SI)與健康對照DC的SI無顯著差異(P>0.05 )。用Ad-GFP感染培養(yǎng)的DCs時，有較好的量效關系和時效關系。當感染增殖率(multiplicity of infection, MOI)為100時，感染24小時接近80.62％的DCs被轉(zhuǎn)染。且轉(zhuǎn)染后的DCs的形態(tài)與對照組相比無明顯異常。當MO

11、I為100，感染48小時后接近85.25％的DC被轉(zhuǎn)染。并且DC經(jīng)腺病毒感染DC 48小時后，F(xiàn)CM檢測細胞表型為成熟DC表型特征。證明Ad-GFP能高效、安全感染培養(yǎng)的DC。 結論:以腫瘤患者經(jīng)動員富集的外周血MNC為來源，聯(lián)合應用GM-CSF、IL-4及TNF-α，在體外可誘導培養(yǎng)出具有典型形態(tài)、表型及免疫活性的DC。腺病毒介導的基因可感染人外周血MNC來源的DC可高效表達。 第三部分：重組腺病毒介導HBsAg和A

12、FP基因修飾樹突狀細胞體外誘導抗HBV相關肝癌免疫實驗的研究 目的:以腺病毒載體介導AFP基因與HBsAg基因修飾樹突狀細胞，使之作為抗原呈遞細胞，同時呈遞HBV肝癌相關抗原AFP和HBsAg，從而誘導更強的特異性CTLs，即可對惡性腫瘤細胞發(fā)揮殺傷效應，又可誘導抗HBV免疫的作用。并探討AFP、HBsAg基因修飾樹突狀細胞較單基因修飾DC瘤苗作為HBV持續(xù)感染的肝癌免疫治療是否更具優(yōu)勢。 方法:分別以Ad-S、Ad-A

13、FP以及Ad-S和Ad-AFP轉(zhuǎn)染DC，以IFA 法檢測三組細胞抗原表達，以FCM檢測感染后DC表型變化。以S-DC、AFP-DC與S/AFP-DC作為刺激細胞，取患者外周靜脈血單個核細胞(PBMC )中非貼壁細胞(淋巴細胞，L)，調(diào)整細胞密度為1 ×106/mL，以含1L-2，10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)；將S-DC、AFP-DC與S/AFP-DC以5×104mL密度分別加入上述淋巴細胞中，共同孵育72h (設未致敏DC組和單獨

14、淋巴細胞組為對照)，再次加入同劑量DC孵育72h，收獲細胞分別稱為S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L。以S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L作為效應細胞，肝癌細胞株HepG2.2.15，SMMC-7721和人肺腺癌H1299作為靶細胞，以不同效靶比接種于96孔板，4h后LDH法測定效應細胞對各腫瘤細胞的殺傷作用。 結果:IFA法檢測結果顯示目的基因均表達于轉(zhuǎn)染的三組

15、細胞中。FCM結果顯示共感染的DC細胞均高表達CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR，表現(xiàn)為成熟DC表型特征。CTL結果顯示S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L組均顯示對HepG2.2.15高效特異的殺傷活性，顯著高于DC-L組和單純L組，其殺傷能力與效應細胞數(shù)量成正比；在同一效靶比時S/AFP-DC-L對HepG2.2.15的殺傷率明顯高于S-DC-L、AFP-DC-L組；而S-DC-L、AFP-DC-

16、L組對HepG2.2.15的殺傷率無明顯區(qū)別；S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L刺激的T細胞組IFN-γ分泌顯著高于DC刺激的L細胞組和L細胞組；但S/AFP-DC-L刺激組IFN-γ分泌顯著高于S-DC-L、AFP-DC-L組；而S-DC-L、AFP-DC-L刺激組IFN-γ分泌無明顯區(qū)別；對照組DC-L和L組IFN-γ分泌亦無明顯區(qū)別。 結論:腺病毒介導AFP和HBsAg基因修飾DC，能夠在體外誘導特異性C