分枝桿菌同源重組系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、分枝桿菌屬包括致病性結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌，目前仍然是人類健康的巨大威脅。分枝桿菌的科學(xué)研究都需要有效的分子遺傳操作技術(shù)，尤其是快速有效的基因突變及基因敲除的分子操作技術(shù)。但是由于分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢、重組酶活性較低等原因，在分枝桿菌內(nèi)的基因操作技術(shù)包括基因敲除技術(shù)的發(fā)展一直落后于其他模式生物。我們?cè)赬er/dif敲除系統(tǒng)的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種高效、通用、完善的基因敲除系統(tǒng)。我們?cè)趐JV53質(zhì)粒中引入gfp報(bào)告基因，用于快速篩選在重組后丟失

2、的質(zhì)粒;構(gòu)建了dif-hyg-dif, dif-zeo-dif表達(dá)盒，在表達(dá)盒兩邊加了多克隆酶切位點(diǎn)便于上下游同源臂的插入;隨后我們利用該系統(tǒng)對(duì)恥垢分枝桿菌的4對(duì)毒素-抗毒素基因進(jìn)行了連續(xù)的讀碼框內(nèi)敲除，表明該系統(tǒng)可成功用于分枝桿菌多基因的連續(xù)敲除，為分枝桿菌功能基因組的研究提供了新的遺傳工具。
　　我們對(duì)結(jié)核分枝桿菌中的毒素-抗毒素系統(tǒng)進(jìn)行了初步的研究，新發(fā)現(xiàn)了6個(gè)在恥垢分枝桿菌中有功能的毒素-抗毒素基因。此外，我們發(fā)現(xiàn)12個(gè)毒