結核分枝桿菌ClpP1重組蛋白的特性探討及初步應用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  構建結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)中ATP依賴的酪氨酸蛋白酶蛋白水解亞基(ATP-dependent caseinolytic proteaseproteolytic subunit,ClpP1)的原核表達質粒,轉入E.coli中誘導表達和純化ClpP1重組蛋白,并通過應激試驗探討ClpP1重組蛋白的生物學特性;將純化的ClpP1重組蛋白免疫白兔制備相應的多克隆抗體,間接E

2、LISA法分析制備抗體的的抗原反應性,并初步評價其應用價值。
  方法:
  1.以Mtb(H37Rv)基因組為模板,用PCR法擴增ClpP1片段,將其定向插入至pET32a(+)載體上,構建ClpP1重組質粒,并用雙酶切和DNA測序進行驗證。
  2.將構建成功的ClpP1重組質粒轉化至Ecoli BL21(DE3)中,IPTG誘導表達ClpP1重組蛋白;經(jīng)Western-blot鑒定蛋白后,采用親和層析法純化目的蛋

3、白。
  3.通過研究ClpP1重組蛋白對宿主菌的生長、耐高溫、抗氧化及生物膜形成等影響的應激試驗和以純化ClpP1重組蛋白為抗原的間接ELISA法一起探討ClpP1重組蛋白的特性。
  4.用純化ClpP1重組蛋白免疫新西蘭白兔,制備ClpP1多克隆抗體及檢測其效價,并用BCG中ClpP1蛋白進一步檢測多克隆抗體的特異性。
  5.通過間接ELISA法,用制備的ClpP1多克隆抗體檢測結核病(tuberculosis

4、,TB)、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺氣腫(Chronic obstructivepulmonary disease,COPD)和肺癌患者血清中ClpP1抗原的水平,計算其檢測的敏感性和特異性。
  結果:
  1.重組質粒pET-32a(+)-ClpP1經(jīng)雙酶切鑒定后,片段大小與理論值相符,測序結果與在Gene Bank中查找的序列一致。
  2.重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定均發(fā)現(xiàn)在約35

5、kDa處出現(xiàn)特異性條帶;通過親和層析法分離和純化ClpP1重組蛋白后,BandScan軟件分析得出重組蛋白表達量約占總菌體蛋白的33%,且純化蛋白的濃度和純度分別為1.1mg/ml和93%。
  3.通過應激試驗得出ClpP1重組蛋白具有促進生長和幫助提高宿主菌對高溫及過氧化氫(Hydrogen peroxide,H2O2)耐受能力的作用,而對生物膜的形成并未有促進作用;ClpP1重組蛋白檢測結核病病人和健康人血清中的ClpP1抗

6、體水平的實驗結果表明實驗組與對照組間具有顯著性差異。
  4.用純化ClpP1重組蛋白免疫新西蘭白兔4次后,檢測其抗體效價為1∶640000;Western-blot結果顯示制備的抗體可較好地與BCG中ClpP1蛋白發(fā)生特異性結合。
  5.用制備的ClpP1多克隆抗體檢測結核病、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺氣腫和肺癌患者血清中ClpP1抗原水平的實驗結果顯示結核病組與其他疾病組間差異顯著,且檢測的敏感性和特異性分別為69.9%

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