“形神觀”指導(dǎo)下模擬微重力對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　組織器官的缺血性損傷嚴(yán)重威脅人類的生命健康,其生存率低、預(yù)后差,成為臨床治療的一個難題。然而,傳統(tǒng)的治療方法難以從根本上恢復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量和功能,改善組織器官的血流灌注。再生醫(yī)學(xué)近二十年的發(fā)展涉及到生物學(xué)、材料學(xué)、工程學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等多學(xué)科,它為治療缺血性疾病提供了新的治療方法。尤其干細(xì)胞的研究,近十年取得的突破性進展為“再生醫(yī)學(xué)”的發(fā)展帶來了新的機遇。將間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域治療各種缺血性疾病,正發(fā)揮著

2、巨大的應(yīng)用潛力。目前,對于間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用,主要以各種手段將其誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞,而誘導(dǎo)方法主要是通過干/祖細(xì)胞的基因修飾、藥物作用以及細(xì)胞因子的聯(lián)合運用等手段,盡管這些方法均可以成功實現(xiàn)誘導(dǎo),但是他們所引起的過度分化問題引起了研究者的關(guān)注。對于具有無限分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞而言,是否能通過改變細(xì)胞自身的某些性質(zhì),達到提高干細(xì)胞誘導(dǎo)效率的目的。但是,目前尚無此類方法的報道。
　　隨著航天事業(yè)的發(fā)展,人們在空間科學(xué)領(lǐng)域的研究取得了

3、一些創(chuàng)新成果,尤其在空間環(huán)境的微重力作用下,細(xì)胞的增殖凋亡和人體各系統(tǒng)功能均呈現(xiàn)了一定的改變。研究證明,微重力作用下細(xì)胞形態(tài)和功能改變與其所處的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境息息相關(guān)。而我們的研究發(fā)現(xiàn),微重力刺激后 BMSCs的形態(tài)由“長梭形”轉(zhuǎn)變?yōu)椤邦悎A形”,這種形態(tài)的改變具有什么意義呢?中醫(yī)學(xué)的“形神觀”闡明了人的形質(zhì)及由形質(zhì)構(gòu)成的形體與生命機能活動的密切聯(lián)系?！靶握呱裰|(zhì),神者形之用”,形態(tài)的變化與其功能的改變是統(tǒng)一的,必然會伴隨產(chǎn)生一系列生理或病理

4、變化。微重力刺激后的BMSCs形態(tài)的圓形改變,可能是一種原始狀態(tài)的回歸,這種回歸將形態(tài)結(jié)構(gòu)有序與功能有序相統(tǒng)一,使干細(xì)胞處于形神相即的平衡環(huán)境中。在這種環(huán)境中,BMSCs自身是否具備了更強的分化潛能呢?其向內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力又會發(fā)生什么樣的變化呢?微重力刺激后,細(xì)胞形態(tài)所呈現(xiàn)的變化影響細(xì)胞分化功能的調(diào)節(jié)機制又是什么呢?據(jù)此,我們進行了以下實驗研究。
　　目的：
　　1.研究BMSCs體外的培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記方法。
　　2

5、.觀察體外條件下模擬微重力刺激對BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用。
　　3.觀察模擬微重力刺激后的BMSCs移植對小鼠缺血下肢血管新生的作用。
　　4.通過觀察模擬微重力刺激后細(xì)胞形態(tài)的變化對細(xì)胞骨架的影響,探討骨架蛋白相關(guān)分子RhoA在BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化中的作用。
　　5.從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度解釋中醫(yī)理論,尋求細(xì)胞形態(tài)和功能統(tǒng)一性與中醫(yī)學(xué)“形神觀”的契合點。
　　方法：
　　1.采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠

6、 BMSCs,觀察細(xì)胞形態(tài);采用 MTT法檢測BMSCs的生長和存活能力;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原 CD29、CD34、CD45、CD90的表達;并將BMSCs分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導(dǎo),采用油紅O和茜素紅染色鑒定分化后的細(xì)胞;凍存和復(fù)蘇BMSCs后,觀察其存活率和生長狀態(tài);應(yīng)用DiI標(biāo)記BMSCs,觀察其標(biāo)記效果和對BMSCs生長狀態(tài)的影響。
　　2.將第3代BMSCs隨機分為空白對照組(control組)、正常

7、重力培養(yǎng)組(NG組)、2D-clinostat刺激培養(yǎng)組(MMG組);在微重力和正常重力刺激72h后,將細(xì)胞加入內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)6天,運用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),分別運用免疫熒光、流式細(xì)胞檢測、Real-time PCR、Western blot觀察誘導(dǎo)后內(nèi)皮樣細(xì)胞Flk-1、vWF的表達;ELISA法檢測血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維生長因子濃度;采用脂質(zhì)吞噬實驗和基質(zhì)膠血管形成實驗檢測正常重力和微重力刺激后BMSCs誘導(dǎo)分化的

8、內(nèi)皮細(xì)胞的功能。
　　3.制備小鼠股動脈結(jié)扎下肢缺血模型,將BMSCs分別進行微重力和正常重力刺激72h后應(yīng)用DiI標(biāo)記,于股動脈結(jié)扎術(shù)后1天進行干細(xì)胞移植。分別于術(shù)后第1d、第21d,使用激光多普勒灌注成像儀檢測患肢血流灌注恢復(fù)情況。術(shù)后21天,處死小鼠。免疫組化HE染色檢查組織損傷和修復(fù)情況;流式細(xì)胞儀檢測缺血肌肉中所含DiI陽性細(xì)胞數(shù);免疫熒光雙染及Western blot檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率及vWF的表達量。
　

9、　4.將第3代BMSCs隨機分為正常重力組(0h組),微重力4h組(4h組)、微重力72h組(72h組)和微重力10d組(10d組)。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;免疫熒光法檢測細(xì)胞骨架F-actin的變化。最后,免疫熒光法確定BMSCs中RhoA的定位,并構(gòu)建RhoA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體,驗證其轉(zhuǎn)染效率;將轉(zhuǎn)染成功后的BMSCs進行微重力72h刺激,并進行內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo),探討 RhoA的活化和抑制對 BMSCs誘

10、導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物 Flk-1、vWF的表達、管腔形成的影響。
　　結(jié)果：
　　1.通過全骨髓貼壁方法培養(yǎng)的BMSCs貼壁生長,原代培養(yǎng)9~12d可傳代,傳代后增殖速度增快,P3代細(xì)胞已基本純化。P3代BMSCs呈紡錘形或長梭形,漩渦狀排列。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定,表達CD29、CD90陽性,表達CD34、CD45陰性,符合BMSCs的特征;其能夠被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞;經(jīng)凍存和復(fù)蘇后的BMSCs生存率高,達90％和85%

11、,且生長狀態(tài)良好;應(yīng)用 DiI標(biāo)記BMSCs的有效率為100%,標(biāo)記72h后觀察發(fā)現(xiàn)其熒光顯色強度無明顯變化,且對BMSCs的生長狀態(tài)無影響。
　　2.微重力刺激72h后,加入內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)的BMSCs,可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Flk-1和vWF在免疫熒光檢測、流式細(xì)胞檢測、mRNA及蛋白水平的表達明顯高于正常重力組。DiI-Ac-LDL吞噬實驗、體外血管成形實驗的陽性結(jié)果也提示誘導(dǎo)后的細(xì)胞具備了內(nèi)皮細(xì)胞的功能。
　　

12、3.對制備下肢缺血模型的小鼠進行微重力刺激后的BMSCs移植,在造模后第21天,與其它組比較,小鼠缺血后肢激光多普勒血流灌注圖像指數(shù)(LDPI index)改善最為明顯。免疫組化HE染色顯示微重力組細(xì)胞移植對缺血肢體的萎縮和肌肉的壞死損傷顯示出明顯的保護作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測DiI陽性細(xì)胞數(shù)和免疫熒光雙染顯示,微重力組移植的BMSCs在體內(nèi)存活、分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目顯著高于正常重力組;缺血下肢中vWF在蛋白水平表達增加。
　　4

13、.微重力刺激0h、4h、72h和10d后,BMSCs形態(tài)由梭形向類圓形轉(zhuǎn)變;流式細(xì)胞儀檢測各時間段細(xì)胞凋亡情況無明顯差異;免疫熒光檢測細(xì)胞骨架變化發(fā)現(xiàn),微重力刺激72h時變化最明顯,微絲表達明顯下降,張力降低。而對于RhoA的表達發(fā)現(xiàn)其在BMSCs中主要分布于胞漿和胞膜上;通過構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式,驗證了活化的RhoA可以促進內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Flk-1和vWF的表達、管腔的形成,而沉默的RhoA則使BMSCs上述生物學(xué)行為受到抑制。

14、　　結(jié)論：
　　1.本實驗采用全骨髓貼壁法成功培養(yǎng)了大鼠BMSCs,并對其進行了分離、純化和擴增,還對其生物學(xué)特性和DiI標(biāo)記進行了初步研究。
　　2.微重力刺激后的BMSCs在體外向內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力增強。
　　3.微重力刺激后的BMSCs移植具有更強的向內(nèi)皮細(xì)胞分化和促進血管新生的能力。
　　4.在微重力刺激72h時,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,RhoA可能通過調(diào)控細(xì)胞骨架解聚,從而促進其誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞和血管形