microRNAs在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞分化中的作用研究.pdf

1、【研究目的】
　　1、利用胰蛋白酶-EDTA消化液分離純化原代培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞，為下一步誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備；
　　2、篩選人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺樣細(xì)胞之間差異表達(dá)的microRNAs，并利用生物信息學(xué)進(jìn)行差異表達(dá) microRNAs的靶基因預(yù)測，尋找人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控microRNAs，并初步預(yù)測其功能；
　　3、探索microRNAs在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞分化中的作用。
　　【研

2、究方法】
　　1、采用II型膠原酶溶液消化皮膚并分離出汗腺細(xì)胞團(tuán)；
　　2、采用胰蛋白酶-EDTA消化液分離純化原代培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞，并進(jìn)行免疫組化鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞，同時(shí)進(jìn)行皮膚HE染色觀察正常人皮膚中的汗腺形態(tài)結(jié)構(gòu)；
　　3、對成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化液誘導(dǎo)后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別進(jìn)行茜素紅、油紅 O染色，鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力。采用Transwell培養(yǎng)板構(gòu)建人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和熱休克汗腺細(xì)胞間接共

3、培養(yǎng)誘導(dǎo)分化模型，并利用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot技術(shù)對誘導(dǎo)后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行汗腺細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測；
　　4、提取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺樣細(xì)胞的總 RNA并作純化標(biāo)記，然后進(jìn)行 microRNAs芯片雜交并利用生物信息學(xué)進(jìn)行靶基因預(yù)測，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行芯片結(jié)果的驗(yàn)證，初步確定汗腺發(fā)育有關(guān)的microRNAs；
　　5、將化學(xué)合成的特定的microRNAs mimics、micro

4、RNAs inhibitor、microRNA Negative Control分別轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并繼續(xù)與熱休克的汗腺細(xì)胞間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)7天，之后采用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測特定microRNAsmimics、microRNAsinhibitor、microRNANegative Control轉(zhuǎn)染后并間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)的效果。
　　【研究結(jié)果】
　　1、經(jīng)胰酶-EDTA消化液分離純化后，

5、去除了新生汗腺細(xì)胞周圍95％以上的成纖維細(xì)胞，得到了高純度的原代培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞。
　　2、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后汗腺細(xì)胞表面標(biāo)志物CEA、CK8、CK19表達(dá)陽性。
　　3、經(jīng)過對 microRNAs芯片結(jié)果對比分析，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和其誘導(dǎo)分化來源的汗腺樣細(xì)胞之間microRNAs表達(dá)水平絕對值相差2倍以上的microRNAs有68個(gè)，其中上調(diào)的有19個(gè)，下調(diào)的有49個(gè)。表達(dá)水平上調(diào)相差5倍以上的microRNAs有

6、microRNA-132-3p、 microRNA-4467、 microRNA-4484、microRNA-146a-5p、microRNA-6126等5個(gè)。表達(dá)水平下調(diào)相差5倍以上的microRNAs有 microRNA-708-5p、microRNA-138-5p、microRNA-6812-5p、microRNA-138-1-3p、microRNA-1281、microRNA-3157-3p、microRNA-4298、micr

7、oRNA-4459等8個(gè)。
　　4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果與microRNAs芯片結(jié)果一致。
　　5、生物信息學(xué)靶基因預(yù)測分析顯示：在這些差異表達(dá)的68個(gè)microRNAs中，有18個(gè) microRNAs靶向于已知的汗腺生長發(fā)育相關(guān)的NF-κB信號通路、MAPK/Erk信號通路、Wnt/β-Catenin信號通路和EDA/EDAR信號通路中的多個(gè)基因。且microRNA-138-1-3p改變明顯并與汗腺發(fā)育EDA/EDA

8、R信號通路中的EDA基因有關(guān)。
　　6、microRNA-138-1-3p mimics轉(zhuǎn)染間接共培養(yǎng)組較microRNA Negative Control轉(zhuǎn)染間接共培養(yǎng)組的EDA基因表達(dá)減弱，形成的CEA、CK19陽性細(xì)胞數(shù)量較少；microRNA-138-1-3p inhibitor轉(zhuǎn)染間接共培養(yǎng)組較microRNA Negative Control轉(zhuǎn)染間接共培養(yǎng)組的EDA基因表達(dá)增強(qiáng)，形成的CEA、CK19陽性細(xì)胞數(shù)量較多。

9、
　　【研究結(jié)論】
　　1、經(jīng)過胰酶-EDTA消化液差速消化法得到了高純度的原代培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞；
　　2、通過間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化模型，能夠誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞分化；
　　3、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和其誘導(dǎo)分化來源的汗腺樣細(xì)胞之間有68個(gè)差異表達(dá)的microRNAs，這些差異表達(dá)的microRNAs可能在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞分化過程中起作用；
　　4、microRNA-138-1-3p作用