Foxo3a通過Bim轉(zhuǎn)錄促進(jìn)NAFLD中Kupffer細(xì)胞自噬及抑制炎癥小體激活的機(jī)制研究.pdf

1、目的：肝臟內(nèi)過多的脂質(zhì)沉積可阻斷Kupffer細(xì)胞（Kupffer cells,KCs）的自噬流，導(dǎo)致炎癥小體的激活，從而加重肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。叉頭蛋白O3a(forkhead box protein O3a, Foxo3a）是連接炎癥反應(yīng)和能量代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子。但是，在高脂飲食（high fat diet,HFD）的條件下，F(xiàn)oxo3a調(diào)節(jié)KCs自噬并抑制炎癥小體激活的機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)將研究非酒精性脂肪性肝?。?/p>

2、nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）模型小鼠中，KCs中Foxo3a的變化以及調(diào)節(jié)KCs自噬流并抑制炎癥小體活性的機(jī)制。
　　方法：
　　1.梯度濃度的棕櫚酸（palmitic acid,PA）（0，0.16，0.32，0.64mM）以及脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）（100ng/ml）聯(lián)合刺激體外的KCs12h:1）蛋白印記法（western blottin

3、g assay,WB）檢測(cè)：①自噬相關(guān)蛋白如Beclin1和LC3；②NLRP3炎癥小體（nucleotide oligomerization domain(NOD)-like receptor family pyrin domain containing3,NLRP3）相關(guān)蛋白如：NLRP3、caspase1和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白（apoptosis associated speck-like protein,ASC）；③Foxo3a及上

4、游相關(guān)蛋白如：腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate ativated protein kinase,AMPK）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidyl inositol3-kinase,PI3K）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（protein serine threonine kinase B,Akt）的表達(dá)變化。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immuno sorbent ass

5、ay, ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的含量。（3）利用2′7′-二乙酰二氯熒光素（dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA）熒光探針并熒光顯微鏡觀察KCs中活性氧產(chǎn)生的情況。
　　2.（1）分別用Foxo3a過表達(dá)質(zhì)粒（Foxo3a overexpression plasmid,Foxo3a-OE）和Foxo3a-短發(fā)夾RNA質(zhì)粒（Fo

6、xo3a-short hairpin RNA plasmid,Foxo3a-shRNA）轉(zhuǎn)染KCs48h后，再利用PA和LPS聯(lián)合刺激KCs12h：①WB檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白及NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)變化；②ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清IL-1β和IL-18的含量；③透射電鏡觀察 KCs自噬小體的分布情況。（2）mRFP-EGFP-LC3缺陷腺病毒感染KCs48 h后，先利用Foxo3a激動(dòng)劑Iturin A預(yù)處理KCs1h，再利用PA和

7、LPS聯(lián)合刺激KCs12h，最后利用熒光顯微鏡觀察LC3標(biāo)記的自噬小體的分布情況。
　　3.（1）Foxo3a-OE轉(zhuǎn)染KCs48h后，利用PA和LPS聯(lián)合刺激KCs12h，再利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測(cè)Foxo3a轉(zhuǎn)錄下游靶分子的mRNA表達(dá)情況。（2）利用Bim-OE及Bim-shRNA體外轉(zhuǎn)染KCs48h后，先分

8、別利用Foxo3a抑制劑SC97和激動(dòng)劑Iturin A預(yù)處理KCs1h，再利用PA和LPS聯(lián)合刺激KCs12h，檢測(cè):①WB檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白及NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)變化；②ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清IL-1β和IL-18的含量。
　　4.24只清潔級(jí)小鼠隨機(jī)分為3組，即正常飼料組（coarse food diet group,CFD），高脂飼料組（high fat diet,HFD）和高脂飼料聯(lián)合Iturin A腹腔注射組

9、（Iturin A），每組8只。3組小鼠均喂養(yǎng)16周后，分別取小鼠的肝臟及外周血：（1）HE染色檢測(cè)肝臟脂肪變情況；（2）全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠肝功能及血脂水平；（3）透射電鏡觀察肝臟組織KCs中的自噬小體分布情況；（4）分離肝組織中KCs，并提取其總RNA和蛋白后：①WB檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白及NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；②RT-PCR檢測(cè)IL-1β和IL-18的mRNA水平。
　　結(jié)果：
　　1. PA聯(lián)合LPS刺

10、激體外KCs組與單獨(dú)LPS處理KCs組比較：（1）自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)下降，LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)比例升高；（2）NLRP3炎癥小體相關(guān)分子NLRP3、ASC、caspase1 p10、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平升高；（3）Foxo3a表達(dá)下降，p-Foxo3a、p-Akt和p-PI3K的表達(dá)升高，而p-AMPK表達(dá)無變化；（4）ROS產(chǎn)生明顯增多。
　　2.（1）KCs過表達(dá)Foxo3a后，可明顯促進(jìn)KCs自噬流，并

11、抑制由PA聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活；（2）KCs沉默F(xiàn)oxo3a后，可進(jìn)一步抑制KCs自噬流，以及進(jìn)一步促進(jìn)由PA聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活。
　　3.（1）KCs過表達(dá)Foxo3a后，PA聯(lián)合LPS刺激組中只有Bim的mRNA表達(dá)明顯低于單獨(dú)過表達(dá)Foxo3a組；（2）①沉默KCs中的Bim，即使給予Foxo3a激動(dòng)劑，KCs的自噬流仍然受阻，并促進(jìn)由PA聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活；②

12、過表達(dá)KCs中的Bim，即使給予Foxo3a抑制劑，KCs的自噬仍然順向進(jìn)行，并抑制由PA聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活。
　　4. Iturin A組小鼠與HFD組小鼠比較：（1）肝組織脂肪變及炎癥反應(yīng)較輕；（2）肝功能及血脂水平較低；（3）肝組織KCs中的自噬小體分布較多；（4）KCs中Foxo3a與Bim的表達(dá)明顯升高，自噬被激活，高脂飲食誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活性較低。
　　結(jié)論：
　　1.游離脂