轉(zhuǎn)錄因子FoXO3a異常在慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞中作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景：慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia，CML)是一種致命性的惡性造血干細(xì)胞疾病，發(fā)生源于人9號(hào)和22號(hào)染色體的易位，導(dǎo)致費(fèi)城染色體t(9;22)(q34;q11)和融合蛋白P210BCR/ABL的形成。P210BCR/ABL顯示異常增強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，過度激活下游Ras、PI3K/Akt等信號(hào)通路導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。FoxO蛋白家族作為轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種重要基因的表達(dá)，而介導(dǎo)細(xì)胞周期、DN

2、A損傷修復(fù)、凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞分化代謝等細(xì)胞生理過程，與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。hSHIP(Human SH2-containing inositol-5-phosphatase)屬于肌醇磷酸酯酶家族，含SH2結(jié)構(gòu)域肌醇磷酸酯酶能通過負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)造血細(xì)胞增殖、存活及終末細(xì)胞活化起作用。本文主要通過血清剝奪實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)染hSHIP基因入K562細(xì)胞，以探討hSHIP基因、PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)FoxO3a表達(dá)含量調(diào)節(jié)和細(xì)

3、胞定位的改變及可能的機(jī)制；并構(gòu)建特異性干擾FoxO3a的shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K562，探究干擾FoxO3a的表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞生存及凋亡的影響。
　　 方法：免疫組化法檢測(cè)FoxO3a的細(xì)胞定位改變；轉(zhuǎn)化提取含hSHIP基因的pcDNA3.1-GFP-hSHIP真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞。采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，半定量RT-PCR法及western blotting檢測(cè)FoxO3a、Akt的mRNA及蛋白

4、表達(dá)含量及磷酸化變化；合成特異性干擾FoxO3a的shRNA，將其插入pRNA-U6.1/Neo載體，構(gòu)建pRNA-U6.1/Neo-FoxO3a干擾質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，western blotting檢測(cè)干擾效率。Hoechst33258/PI雙染色法分析細(xì)胞凋亡；MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)影響。
　　 結(jié)果：免疫組化實(shí)驗(yàn)證明，血清激活PI3K/Akt信號(hào)通路可導(dǎo)致FoxO3a蛋白由胞核重定位于胞漿；轉(zhuǎn)染了hSHIP基

5、因的K562細(xì)胞株(K562/hSHIP-GFP)與對(duì)照組(K562/GFP)相比，AktmRNA、總Akt蛋白及Akt磷酸化水平明顯下調(diào)，F(xiàn)oxO3a蛋白的mRNA及蛋白含量明顯增高；成功構(gòu)建pRNA-U6.1/Neo-FoxO3a干擾質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，結(jié)果顯示FoxO3amRNA及蛋白的表達(dá)含量明顯減少。與對(duì)照組相比，Hoechst33258/PI檢測(cè)顯示干擾組細(xì)胞凋亡明顯減少；MTT法顯示K562細(xì)胞生長(zhǎng)顯著增加。