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文檔簡介
1、目的:
能量限制(caloric restriction,CR)在生物體的健康與壽命延長中所起的重要作用已被廣泛認可,近年的研究表明CR也能延長哺乳動物卵巢的壽命。我們的前期研究發(fā)現(xiàn), SIRT1可能在能量限制介導的提高卵巢卵泡儲備、延長卵巢壽命的機制中起著關鍵的調(diào)控作用。但其調(diào)控機制尚未清楚。本研究通過建立SIRT1基因敲入小鼠的模型,使得SIRT1在卵母細胞中特異性持續(xù)高表達,觀察比較SIRT1基因敲入小鼠與野生型小鼠在卵
2、泡發(fā)育和卵巢壽命、SIRT1、FOXO3a及mTOR蛋白表達等方面的差異,旨在研究SIRT1基因敲入小鼠是否可以提高卵巢儲備及延長卵巢壽命,以及SIRT1通過何種信號通路影響卵巢儲備及卵巢壽命。
方法:
在體內(nèi)介導Rosa26基因座LoxP位點插入SIRT1的基因片段,利用Cre重組酶組織表達的特異性從而獲得卵巢卵母細胞特異性持續(xù)高表達SIRT1的基因敲入小鼠,并篩選出純合子高表達小鼠、雜合子高表達小鼠及陰性對照的小
3、鼠,與同齡C57BL/6野生型小鼠對比。觀察小鼠的陰道開口時間及首次出現(xiàn)動情的時間,部分小鼠至成年(35天)時,分4組(野生型組、陰性對照組、雜合子高表達組、純合子高表達組),每組分別6只小鼠,麻醉后頸椎脫臼處死小鼠,取小鼠雙側(cè)卵巢,固定后石蠟包埋備用。剩余部分小鼠同樣分4組(野生型組、陰性對照組、雜合子高表達組、純合子高表達組),每組分別6只小鼠,進行生殖能力實驗,分別記錄每只小鼠每胎的產(chǎn)仔數(shù)量及產(chǎn)仔年齡,小鼠至老年(15月齡)時,麻
4、醉后頸椎脫臼處死小鼠,取小鼠雙側(cè)卵巢,固定后石蠟包埋備用。以上35天齡成年小鼠及15月齡老年小鼠蠟塊切片后,進行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色觀察,并選取7張有代表性的組織切片,計數(shù)各級卵泡數(shù)以及各級卵泡數(shù)占卵泡總數(shù)的比例。同時每只小鼠的SIRT1、FOXO3a、mTOR各個因子各取1張卵巢切片行免疫組化,檢測SIRT1、FOXO3a、mTOR的蛋白表達定位情況以及進行免疫組化EI(extent a
5、nd intensity)評分半定量分析比較各組間蛋白表達的強弱情況。
結(jié)果:
陰道開口及動情周期:與野生型小鼠相比,轉(zhuǎn)基因小鼠的陰道開口時間及第一次出現(xiàn)動情周期天齡延遲(29.16?0.65day vs26.14?0.62day,P<0.05;32.85?0.55day vs31.66?1.14day,P<0.05)。生殖能力:雖然第一胎產(chǎn)仔月齡及第一胎產(chǎn)仔數(shù)在轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠間沒有差異(4.55?0.33
6、month vs5.46?0.45 month, P>0.05;7.07?0.48 vs7.80?0.35, P>0.05),但轉(zhuǎn)基因小鼠的末胎產(chǎn)仔月齡大于野生型小鼠(10.20?0.93month vs7.16?0.65month,P<0.05),轉(zhuǎn)基因小鼠的末胎產(chǎn)仔數(shù)高于野生型小鼠(7.20?0.16 vs6.64?0.19, P<0.05),轉(zhuǎn)基因小鼠的總胎次多于野生型小鼠的總胎次(2.40?0.12times vs1.530.0
7、9times, P<0.05),轉(zhuǎn)基因小鼠的總產(chǎn)仔數(shù)高于野生型小鼠(16.40?0.27 vs13.38?0.15,P<0.05)。卵泡計數(shù):HE染色結(jié)果顯示,35天齡成年鼠純合子高表達組或雜合子高表達組的健康卵泡數(shù)的均數(shù)及比例均顯著高于野生型或陰性對照組(474.70?57.00 or383.88?52.15 vs264.75?28.72 or223.88?28.79,P?0.05;80.76%?2.68%or77.69%?2.74%
8、vs62.80%3.18%or60.68%4.60%,P<0.05),而純合子高表達組或雜合子高表達組的閉鎖卵泡數(shù)則低于野生型組或陰性對照組(111.00?1.57 or105.75?7.31 vs154.00?9.10 or143.25?2.05, P?0.05;19.23%?2.6%or22.3%?2.7%vs37.2%?3.9%39.3%?4.5%,P<0.05).35天齡成年鼠的純合子高表達組或雜合子高表達組的原始卵泡的均數(shù)及比
9、例均顯著高于野生型或陰性對照組(264.75?34.58 or205.00?48.34 vs88.75?13.34 or78.75?19.61, P?0.05;40.8%?0.04% or40.5%?6.9%vs20.9%?2.2%or20.8%?0.04%,P<0.05)。同樣的,15月齡老年鼠純合子高表達組或雜合子高表達組的健康卵泡均數(shù)及比例均顯著高于野生型組或陰性對照組(28.50?4.68 or36.40?5.05 vs11.0
10、0?3.59 or10.33?2.72, P?0.05;75.1%?4.8%or76.3%?3.4%vs30.7%?8.9%or43.8%?11.4%,P?0.05),而純合子高表達組或雜合子高表達組的閉鎖卵泡均數(shù)及比例均低于野生型組(9.00?1.95 or11.00?1.92 vs20.50?4.46, P?0.05;24.9%?4.8%or23.7%?3.4%vs69.3%?8.9%,P?0.05)。15月齡的純合子高表達組或雜合
11、子高表達組的原始卵泡均數(shù)及比例均高于野生型或陰性對照組(1.83?1.28 or1.60?0.81 vs0.33?0.21 or0.33?0.21, P?0.05;4.1%?2.8%or2.8%1.4%vs0.7%?0.5%or1.0%?0.7%,P?0.05)。蛋白表達:免疫組化結(jié)果提示,35天成年鼠及15月齡老年鼠SIRT1,FOXO3a,mTOR均表達于健康的卵泡,閉鎖卵泡不表達。SIRT1主要表達在卵母細胞核及細胞漿,顆粒細胞表
12、達極弱或者不表達。FOXO3a在原始卵泡中主要表達于卵母細胞核及細胞漿,在發(fā)育卵泡(初級卵泡、次級卵泡、竇狀卵泡)中主要表達于細胞漿。mTOR主要表達于卵母細胞核及卵母細胞漿,顆粒細胞表達極弱或者不表達。同時,免疫組化半定量檢測EI評分結(jié)果提示,35天齡純合子高表達組或雜合子高表達組小鼠的SIRT1表達高于野生型小鼠或陰性對照組小鼠(7.40?1.02 or5.63?0.91 vs2.20?0.58 or2.00?0.54,P<0.05
13、);15月齡純合子高表達組或雜合子高表達組小鼠的SIRT1表達高于野生型組或陰性對照組小鼠(3.71?1.10 or2.00?1.16 vs0.80?0.48 or1.40?1.09,P<0.05)。35天齡純合子高表達組或雜合子高表達組小鼠的FOXO3a的表達高于野生型組或陰性對照組(4.8?0.80 or3.13?0.58 vs1.60?0.24 or1.60?0.24, P<0.05)。15月齡純合子高表達組或雜合子高表達組小鼠的
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