miRNA-152在2型糖尿病發(fā)病中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：miRNAs通過調(diào)控胰島β細(xì)胞的分化，胰島素的合成與分泌，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑參與調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取和血糖的平衡，在2型糖尿病（T2DM）的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的出現(xiàn)中發(fā)揮重要作用。因此，鑒定新的miRNA分子并揭示其在2型糖尿病發(fā)病中的作用機(jī)制具有重要的價(jià)值。
　　目的：以2型糖尿病患者和健康人的外周血液為對象，研究miRNA-152分子在兩組人群中的差異，分析其表達(dá)水平與糖尿病臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性；利用生物信息學(xué)分析和細(xì)胞實(shí)

2、驗(yàn)，篩選出可能受到 miRNA-152直接調(diào)控的靶基因，構(gòu)建含有靶基因序列的重組質(zhì)粒，進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-152對靶基因的調(diào)節(jié)作用，揭示miRNA-152在T2DM發(fā)生中的作用及其機(jī)制。
　　方法：⑴采集年齡相仿的健康獻(xiàn)血者和未經(jīng)治療、且無并發(fā)癥的T2DM患者的空腹外周血，EDTA抗凝處理后置于-80℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)收集兩組人群的血液臨床生化檢測數(shù)據(jù)及T2DM患者的病歷資料。⑵在血液RNA中加入外參基因，使用Trizol法提取血

3、液總RNA，加A尾反應(yīng)使miRNA修飾上Poly(A)尾，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到miRNA的cDNA。⑶利用熒光定量PCR技術(shù)鑒定兩組人群中 miRNA-152表達(dá)水平的差異。利用miRNA-152正向引物和反向通用引物擴(kuò)增miRNA-152分子，同時(shí)擴(kuò)增外參基因作為對照，分析miRNA-152分子水平在兩組人群中的表達(dá)差異。⑷根據(jù)兩組人群的臨床血液生化數(shù)據(jù)，分析miRNA-152水平分別與空腹血糖水平、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、個(gè)

4、體肥胖指數(shù)等糖尿病指標(biāo)之間的相關(guān)性。⑸使用權(quán)威的miRNA靶基因預(yù)測軟件：DIANA TOOLS、miRanda和TargetScan，篩選可能受到miRNA-152調(diào)控且與T2DM發(fā)生相關(guān)的潛在靶基因。⑹在肝癌HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA模擬物miRNA-152mimic，同時(shí)轉(zhuǎn)染NC-mimic作為陰性對照。熒光定量PCR檢測miRNA-152在細(xì)胞中的表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參基因。同時(shí)檢測過表達(dá)miRNA-152后靶基因的表達(dá)情

5、況，以actin作為內(nèi)參基因。初步將表達(dá)水平下調(diào)明顯的基因作為靶基因。⑺分析靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)域（3’UTR區(qū)域），確定其可能與miRNA-152結(jié)合的潛在區(qū)域。設(shè)計(jì)加入雙酶切位點(diǎn)的引物，采用PCR方法擴(kuò)增出編碼靶基因3’UTR區(qū)域的部分DNA片段，雙酶切后克隆入pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因載體；菌落PCR鑒定陽性克隆，測序確定載體是否構(gòu)建成功。⑻將空載體和重組載體分別與miRNA-152 mimic或NC-mimic在H

6、epG2細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)進(jìn)行雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)，檢測不同組細(xì)胞熒光素酶活性的變化情況，在細(xì)胞內(nèi)確定miRNA-152對靶基因的直接調(diào)控作用。
　　結(jié)果：①miRNA-152在正常和 T2DM人群中的表達(dá)差異：熒光定量 PCR結(jié)果顯示miRNA-152分子在T2DM患者中呈異常高表達(dá)，升高達(dá)1.4倍左右。進(jìn)一步分析顯示， miRNA-152分子水平與兩組人群的空腹血糖水平呈顯著正相關(guān)，與高密度脂蛋白水平呈明顯負(fù)相

7、關(guān)，但與甘油三酯水平、低密度脂蛋白、總膽固醇水平及肥胖指數(shù)并無明顯相關(guān)性。②篩選miRNA-152的潛在靶基因：利用生物信息學(xué)分析，初步篩選出8個(gè)與T2DM發(fā)生相關(guān)且可能受到miRNA-152調(diào)控的潛在靶基因。③過表達(dá)miRNA-152后對潛在靶基因的影響：在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-152 mimic后發(fā)現(xiàn)，miRNA-152在細(xì)胞中過量表達(dá)近百倍左右。miRNA-152水平升高后靶基因ADAM17、CSF1和MET的表達(dá)水平均

8、發(fā)生下調(diào)。④靶基因重組載體的構(gòu)建：進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析顯示，CSF1和MET兩個(gè)基因mRNA的3’UTR區(qū)域都含有多個(gè)與miRNA-152種子區(qū)潛在結(jié)合的位點(diǎn)。利用分子克隆的方法，將編碼這兩個(gè)基因3’UTR區(qū)域的DNA片段克隆入pmirGLO載體，測序結(jié)果顯示兩個(gè)重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功。⑤雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定miRNA-152對靶基因的直接調(diào)控作用：共轉(zhuǎn)染后的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示， CSF1和MET的重組載體分別與miRNA-

9、152轉(zhuǎn)染后均能夠檢測到熒光素酶活性的明顯下降，說明miRNA-152直接參與了CSF1和MET基因表達(dá)的調(diào)控。
　　結(jié)論：⑴分析健康人群和T2DM人群的臨床樣本后發(fā)現(xiàn)，miRNA-152在T2DM患者的血液中呈異常高表達(dá)，且miRNA-152分子水平與兩組人群的空腹血糖水平呈顯著正相關(guān)，與高密度脂蛋白水平呈明顯負(fù)相關(guān)。⑵確定CSF1和MET可能是miRNA-152直接作用的靶基因，提示過量表達(dá)的miRNA-152可能通過抑制這些