糖尿病大鼠MMP-2-TIMP-2的動(dòng)態(tài)變化及其在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、研究背景及目的 糖尿病腎病(diabeticnephropathyDN)是糖尿病(diabetesmellitusDM)的重要并發(fā)癥和致死原因，也是造成慢性腎衰的常見(jiàn)原因之一。其主要病理特點(diǎn)是系膜區(qū)系膜細(xì)胞增生，大量基質(zhì)堆積，系膜區(qū)變寬或結(jié)節(jié)形成及腎小管、腎小球基底膜(glomerularbasementmembraneGBM)增厚，隨著病情的進(jìn)展逐步發(fā)展為腎小球硬化，最終導(dǎo)致整個(gè)腎臟功能的喪失。腎小球系膜基質(zhì)堆積和GBM增厚的

2、主要原因目前認(rèn)為是由于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrixECM)代謝紊亂，其合成增加和(或)降解減少所致?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinasesMMPs)是ECM的主要降解酶。研究表明MMPs特別是明膠酶及其特異性抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinasesTIMPs)參與了多種腎臟疾病的發(fā)病過(guò)程，然而對(duì)于其是否參與糖尿病腎

3、病的發(fā)生、發(fā)展，以及其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究用鏈脲佐菌素制成了糖尿病大鼠模型，首次從基因表達(dá)、蛋白及生物活性三個(gè)水平對(duì)不同病程DM大鼠的血清和腎組織MMP-2及其特異性抑制因子TIMP-2進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)了Ⅳ型膠原(typeⅣcollagenⅣ-C)在腎臟的表達(dá)并觀察腎臟功能及其形態(tài)學(xué)的動(dòng)態(tài)變化，分析它們之間的相關(guān)關(guān)系，探討MMP-2/TIMP-2在DN發(fā)病機(jī)制中的作用，為DN的早期防治開(kāi)拓一種新思路。 研究方法：

4、 1.建立DM大鼠模型：選6-8周齡Wistar大鼠，體重200-250克，分為正常對(duì)照組(NC)和糖尿病組(DM)，再分別分為1周、4周、8周、12周、20周組，糖尿病模型采用禁食12小時(shí)后一次性按60mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素STZ(Sigma公司)，3d后取尾靜脈血，測(cè)定血糖，取在整個(gè)病程中血糖≥16.7mmol/L的為糖尿病大鼠。 2.腎臟功能的檢測(cè)：宰殺前一天用代謝籠收集24小時(shí)尿，測(cè)24小時(shí)尿蛋白定量，尿肌酐(u

5、rinarycreatinineUcr)；下腔靜脈取血，分離血清測(cè)血糖、血肌酐及尿素氮，并計(jì)算肌酐清除率以代替腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)；取雙腎，去包膜稱(chēng)重，計(jì)算腎重/體重以估測(cè)腎臟的大小。 3.腎臟組織的形態(tài)學(xué)檢測(cè)：①常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腎小球及腎小管形態(tài)學(xué)改變；②過(guò)碘酸雪夫氏反應(yīng)(PAS)染色觀察系膜基質(zhì)及腎小球基底膜及腎小管基底膜厚度的變化；⑨透射電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)的改變。 4.腎組織MMP-2、TIMP-2、Ⅳ

6、-C的蛋白表達(dá)用免疫組化方法檢測(cè)。 5.腎組織MMP-2活性用明膠酶譜分析法檢測(cè)。 6.腎組織中MMP-2、TIMP-2mRNA表達(dá)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)式反應(yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定。 7.血清MMP-2、TIMP-2含量用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)定量檢測(cè)。 研究結(jié)果： 1.大鼠體重及血糖的變化：糖尿病大鼠體重自第1周起與正常對(duì)照組相比即有明顯下降，且隨著病程的進(jìn)展逐漸降低；血糖明顯高于正常對(duì)

7、照組且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大于16.7mmol/L。 2.腎臟功能的改變：糖尿病組與同期對(duì)照組相比24小時(shí)尿蛋白排泄量、BUN均明顯升高，且隨病程延長(zhǎng)逐漸增加；而GFR在第12周前逐漸增加，12周時(shí)達(dá)最高值，后逐漸下降，但仍高于正常對(duì)照組水平。 3.腎臟的組織形態(tài)學(xué)改變：與正常對(duì)照組相比糖尿病大鼠腎組織形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，且隨著病程的延長(zhǎng)逐漸加重。光鏡下可見(jiàn)腎小球增大，毛細(xì)血管擴(kuò)張，系膜細(xì)胞增殖，系膜基質(zhì)增多，基底膜增厚，腎

8、小管上皮細(xì)胞空泡和顆粒變性，間質(zhì)灶性纖維化，腎小管萎縮，小動(dòng)脈管壁增厚、變性；PAS染色可見(jiàn)腎小球和腎小管基底膜明顯增厚；電鏡下可見(jiàn)上皮細(xì)胞足突肥大、增寬、融合，基底膜增厚，ECM增多。隨著病程的延長(zhǎng)上述變化逐漸加重。 4.腎組織Ⅳ-C蛋白表達(dá)的改變：糖尿病組與正常對(duì)照組比較在1周時(shí)Ⅳ-C蛋白表達(dá)即明顯增加，且隨著病程的延長(zhǎng)逐漸增加；Ⅳ-C在腎組織的蛋白表達(dá)與24小時(shí)尿蛋白排泄量呈正相關(guān)。 5.腎組織MMP-2活性的改變

9、：糖尿病組在1周時(shí)與正常對(duì)照組比較活性即有下降，且隨著病程的延長(zhǎng)逐漸下降；腎組織MMP-2活性與Ⅳ-C的蛋白表達(dá)及24小時(shí)尿蛋白排泄量呈負(fù)相關(guān)。 6.腎組織MMP-2蛋白及mRNA表達(dá)：糖尿病組與正常對(duì)照組比較在1周時(shí)MMP-2蛋白及mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組比較明顯下降，且隨著病程的延長(zhǎng)逐漸下降，與腎組織的MMP-2活性呈正相關(guān)，與Ⅳ-C的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 7.腎組織TIMP-2的蛋白及mRNA表達(dá)：糖尿病組與正常對(duì)照

10、組比較在1周時(shí)TIMP-2蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加，隨著病程的延長(zhǎng)逐漸增加，與腎組織MMP-2活性呈負(fù)相關(guān)，與Ⅳ-C蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。 8.血清中MMP-2、TIMP-2的改變：糖尿病組與正常對(duì)照組比較在1周時(shí)血清中MMP-2、TIMP-2即有明顯增加，隨著病程的延長(zhǎng)逐漸增加，血清中MMP-2與腎組織MMP-2活性及蛋白和mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；血清中TIMP-2與腎組織TIMP-2蛋白及mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。 研究結(jié)論

11、： 1.糖尿病大鼠早期即有腎臟功能和病理形態(tài)的改變，且隨著病程的延長(zhǎng)逐漸加重，提示糖尿病早期即有腎病的發(fā)生。 2.糖尿病大鼠腎組織存在Ⅳ-C的過(guò)度表達(dá)，與MMP-2的活性呈負(fù)相關(guān)。 3.糖尿病大鼠腎功能及病理形態(tài)的改變與Ⅳ-C的過(guò)度表達(dá)和MMP-2的活性降低密切相關(guān)。 4.在糖尿病大鼠早期即有腎組織MMP-2活性的降低且隨著病程延長(zhǎng)逐漸降低，同時(shí)伴有蛋白及mRNA水平的下調(diào)和TIMP-2蛋白及mRNA水平

12、的上調(diào)，提示MMP-2/TIMP-2參與了糖尿病腎病的發(fā)病過(guò)程。 5.相關(guān)關(guān)系分析表明血清中MMP-2與腎組織MMP-2活性及蛋白和mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；血清中TIMP-2與腎組織TIMP-2蛋白及mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。 本課題的創(chuàng)新和意義： 1.本研究首次對(duì)糖尿病大鼠腎臟Ⅳ-C、MMP-2/TIMP-2進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，且證明在1周時(shí)即存在腎組織中MMP-2的活性和表達(dá)的降低及TIMP-2、Ⅳ-C表達(dá)的升高，且他