NG2蛋白多糖在糖尿病腎病發(fā)病機制中的作用.pdf

1、研究背景：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)正在逐年升高。DN已經(jīng)成為歐美誘導終末期腎衰竭需要腎替代治療的最常見的原因。早期DN的主要特征為小球肥大和進行性細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)增加，損害逐漸加重和持續(xù)性蛋白尿?qū)е履I小球硬化，腎功能惡化和慢性腎功能衰竭。.小球肥大和ECM積聚的分子機制涉及到多種因素和途徑，是目前研究的熱點。NG2是一種重要的硫酸軟骨

2、素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG)，分子結構顯示NG2具有完整的跨膜結構，可與胞外多種配體結合，并介導胞內(nèi)信號轉導，因此在調(diào)節(jié)細胞與細胞，細胞與ECM的相互作用中發(fā)揮了重要的功能。近年來研究者們發(fā)現(xiàn)NG2不僅表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)，許多間葉細胞中也發(fā)現(xiàn)NG2的表達，如成軟骨細胞、骨骼肌成肌細胞、表皮干細胞、血管平滑肌細胞/周細胞以及

3、黑色素瘤細胞等。但NG2在腎臟組織中的表達、定位以及功能仍未見報道。
　　 目的：本課題旨在觀察NG2在大鼠腎臟中的表達和定位，以及NG2在糖尿病大鼠模型中的表達變化，探討NG2與DN腎小球肥大和ECM積聚之間的關系，從而為DN的發(fā)病機制提供新的理論，并為DN的早期防治提供新的作用靶點。
　　 方法：(1)雄性SD大鼠麻醉后，灌注固定，取腎臟皮質(zhì)，免疫熒光法和免疫電鏡法觀察NG2在大鼠腎臟組織中的定位。取新鮮的腎臟皮質(zhì)，

4、RT-PCR法和western blot法分別檢測NG2 mRNA和蛋白的表達。(2)鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)65 mg/kg單次腹腔注射，復制糖尿病大鼠模型，分別于2、4、8周各處死6只。觀察腎臟組織病理學和生化指標改變。取腎臟皮質(zhì)，免疫熒光染色，熒光定量PCR法和western blot法觀察NG2表達的變化。(3)體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1，高糖(30mmol/L)刺激24 hs后觀察NG2表達的

5、變化。構建兩條針對NG2的shRNA真核表達載體Pgenesil-siNG21和Pgenesil-siNG22，檢測干擾效率，取效率高的質(zhì)粒進行后續(xù)實驗。(4)將Pgenesil-siNG2和NG2表達載體(pcDNA-NG2)轉染入HBZY-1細胞，MTT法觀察細胞增殖情況，流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞周期，熒光定量PCR法觀察ECM成分collagen VI和 Laminin的表達變化。
　　

6、結果：(1)共聚焦顯微鏡和免疫電鏡觀察均發(fā)現(xiàn)正常大鼠腎臟中可見NG2的表達，主要定位于腎小球系膜區(qū)，包括系膜細胞和系膜基質(zhì)。RT-PCR法和western blot法分別檢測NG2 mRNA和蛋白的表達，結果提示正常大鼠腎臟中NG2表達水平較低。(2)STZ腹腔注射3天后，大鼠血糖>16.7mmol/L，視為達到糖尿病診斷標準，且在處死前的8周內(nèi)始終維持高血糖水平。糖尿病大鼠的血糖、腎重/體重和尿白蛋白/肌酐明顯高于對照組，有統(tǒng)計學意義

7、(P<0.05或P<0.01)。8周糖尿病大鼠可見明顯的腎小球肥大和系膜區(qū)增生，平均腎小球體積為(1.29±0.11)x106μm3，與對照組(1.14±0.12)x106μm3相比，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；電鏡顯示糖尿病組大鼠部分足突融合，中度系膜基質(zhì)增生。免疫熒光染色顯示糖尿病大鼠NG2表達也定位于系膜區(qū)，但較正常組熒光強度增加；熒光定量 PCR和western blot結果顯示糖尿病大鼠NG2 mRNA和蛋白表達增高。與對應

8、時間段對照大鼠相比，2周糖尿病大鼠NG2 mRNA水平顯著增高(138±76)[％]，達到峰值；4周和8周糖尿病大鼠也分別增高(74±40)[％]和(73±37)[％]。(3)高糖(30mmol/L)刺激HBZY-1細胞24 hs后，NG2表達水平較正常對照組和甘露醇對照組明顯升高，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。構建兩條針對NG2的shRNA(Pgenesil-siNG21和Pgenesil-siNG22)，以及隨機陰性對照Pgenes

9、il-siNC，經(jīng)酶切鑒定和DNA測序均符合設計要求。熒光定量PCR結果顯示Pgenesil-siNG21和Pgenesil-siNG22對HBZY-1細胞中NG2基因的抑制率分別為54[％]和72[％]，選取Pgenesil-siNG22做后續(xù)實驗。(4)將Pgenesil-siNG22、Pgenesil-siNC、NG2表達質(zhì)粒(pcDNA-NG2)和空質(zhì)粒pcDNA分別轉染入HBZY-1細胞，MTT法檢測結果顯示質(zhì)粒pcDNA-N

10、G2轉染組細胞吸光度值(1.309±0.018)較對照組pcDNA轉染組(1.016±0.031)明顯增加，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而質(zhì)粒Pgenesil-siNG22轉染組細胞吸光度值(0.835±0.038)較對照組Pgenesil-siNC轉染組(1.021±0.049)明顯下降，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示NG2基因?qū)BZY-1細胞有促進增殖的作用。FCM結果顯示質(zhì)粒pcDNA-NG2轉染組和Pgenesil-

11、siNG22轉染組細胞周期中位于S期的比例分別為17.66％和2.88％，較對照組(10.46％和10.47％)有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。熒光定量PCR法結果顯示質(zhì)粒pcDNA-NG2轉染組細胞α2 (VI)collagen和Laminin β1 mRNA表達較對照組明顯升高，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而質(zhì)粒Pgenesil-siNG22轉染組細胞α2 (VI)collagen和Laminin β1 mRNA表達較對照組顯著減少

12、，有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。
　　 結論：(1)NG2在大鼠腎臟中有表達，主要定位于腎小球系膜區(qū)，包括系膜細胞和系膜基質(zhì)。(2)糖尿病大鼠腎臟NG2表達明顯增加，并有時序性改變，2周時達到高峰，后維持較高水平至觀察的第8周。(3)體外高糖刺激腎小球系膜細胞可見NG2表達的升高。從沉默和過表達NG2兩方面的實驗觀察發(fā)現(xiàn)，NG2基因有促進系膜細胞增殖和ECM成分collagen VI和Laminin增生的作用。(4