低氧條件下紅景天苷對脂多糖誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞活性氧及炎癥因子表達(dá)的影響.pdf

1、研究目的:牙周炎(Periodontitis)是威脅人類口腔健康的兩大慢性疾病之一，是由病原體及其代謝產(chǎn)物，尤其是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激引起的持續(xù)性炎癥免疫反應(yīng)，導(dǎo)致局部牙周支持組織破壞，是牙齒松動和脫落的一個主要原因。流行病學(xué)調(diào)查顯示:在復(fù)雜多變的高原環(huán)境下，機(jī)體血液變得“黏、濃、聚、凝”，牙周組織中氧濃度急劇降低，氧化應(yīng)激升高，齦下菌群種類更加豐富，其中G-厭氧菌大量繁殖，牙周組織微環(huán)境變化，對細(xì)

2、菌及其代謝產(chǎn)物的抵抗力下降，牙周炎癥加重。由此可見高原牙周病的發(fā)病機(jī)制具有一定的特殊性，其重要防治策略是抗炎和抗氧化。然而，目前尚沒有針對高原牙周病的特異性治療藥物，牙周炎的治療仍是基礎(chǔ)治療加藥物治療或牙周手術(shù)治療等，不僅治療周期長，預(yù)后不佳，并且人工合成的治療藥物大多具有潛在的不安全性，侵襲性治療還會給患者造成心理上的陰影，因此非常有必要尋找一種安全有效的藥物。近年來，紅景天苷(Salidroside，SAL)受到越來越多學(xué)者的關(guān)注，

3、它是從藥用植物紅景天中提取的一種主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗抑郁、抗炎、抗氧化等多種作用。但是， SAL是否對高原牙周病有治療作用目前還未見相關(guān)報道。為探討SAL對高原牙周病的作用，本課題參照國內(nèi)外研究，選用牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg) LPS刺激人牙周膜細(xì)胞建立牙周炎細(xì)胞模型并在1％O2低氧環(huán)境下培養(yǎng)，檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)和細(xì)胞內(nèi)

4、外的腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosisfactor alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-kappaB，NF-κB)及胞漿中抑制蛋白(Inhibitor kappa B，IκBa)磷酸化的表達(dá)情況，初步探討SAL對低氧條件下LPS誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，為預(yù)

5、防或治療高原牙周病提供了新的思路。
　　研究方法:1、改良酶消化組織塊貼壁法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞。2、用含SAL終濃度為0、30、60、100 ug/mL SAL的DMEM分別培養(yǎng)第5代人牙周膜細(xì)胞，并于培養(yǎng)后1、2、3、4、5、6d各時間點(diǎn)，采用MTT法檢測各濃度組細(xì)胞的增殖活性。3、模型建立及實(shí)驗(yàn)分組:取第5代人牙周膜細(xì)胞并將其隨機(jī)分為5組，分別用不含LPS和SAL的DMEM（A組，對照組）以及含10ug/mL LPS+0ug

6、/mL SAL(B組，單純LPS組)、10ug/mL LPS+30ug/mL SAL（C組）、10ug/mlLPS+60ug/mL SAL(D組)、10ug/mL LPS+100ug/mL SAL(E組)的DMEM進(jìn)行1％ O2低氧連續(xù)培養(yǎng)6h后，收集各組細(xì)胞及其上清液，分別用2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽法(2，7-dichlorodihydrofluoresceindiacetate， DCFH-DA)檢測各組細(xì)胞中的ROS表達(dá)水平

7、、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked-ImmunosorbentAssays，ELISA)檢測各組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平、Western blot法檢測A組、B組和10ug/mL LPS+100ug/mLSAL細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路的

8、磷酸化情況。
　　研究結(jié)果:1、采用改良酶消化組織塊貼壁法，在體外能成功獲得原代人牙周膜細(xì)胞。2、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:本實(shí)驗(yàn)最大劑量100ug/ml的SAL不影響低氧條件下LPS誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞的增殖活力(P＞0.05)。3、DCFH-DA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對照組比較，單純LPS組人牙周膜細(xì)胞內(nèi)的ROS顯著升高(P＜0.05);與LPS組比較，3個SAL實(shí)驗(yàn)組人牙周膜細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)降低(P＜0.05)，且具有劑量依賴性。4、R

9、T-PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:和對照組比較，單純LPS組人牙周膜細(xì)胞的TNF-α、IL-1β和IL-6在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)顯著升高(P＜0.05);與單純LPS組比較，3個SAL實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1β和IL-6在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)降低(P＜0.05)，且具有劑量依賴性。5、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:和對照組比較，單純LPS組人牙周膜細(xì)胞的NF-κB和IκBa的磷酸化水平升高(P＜0.05)

10、;與單純LPS組比較，100ug/ml的SAL實(shí)驗(yàn)組的人牙周膜細(xì)胞的NF-κB和IκBa的磷酸化水平降低(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)最大劑量100ug/ml的SAL不影響人牙周膜細(xì)胞的增殖，無毒副作用，是安全的。2、SAL可降低低氧條件下LPS誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞的ROS和TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子表達(dá)，具有一定的保護(hù)人牙周膜細(xì)胞的作用。這個保護(hù)機(jī)制可能是SAL抑制人牙周膜細(xì)胞NF-κB信號通路的磷酸化